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Fertility

Comparación de medios de maduración in Vitro de ovocitos inmaduros: la efectividad del medio de cultivo para blastocitos

Objetivo: Comparar tres medios diferentes de maduración in Vitro (IVM) para ovocitos inmaduros. Diseño: Estudio experimental. Ámbito: Laboratorio de fecundación in Vitro. Sujetos experimentales: ratones hembras y machos BDFI. Intervenciones: Obtención y maduración de ovocitos en estadio de vesícula germinal rodeada de cumulus de acuerdo a uno de los tres protocolos; grupo A: medio convencional para IVM, grupo B: medio de cultivo para blastocitos, grupo C: medio de cultivo para tejidos (TCM) 199. Principales parámetros estudiados: Tasas de maduración, fecundación y desarrollo de ovocitos inmaduros. Resultado(s): Un total de 653 ovocitos inmaduros fueron cultivados in Vitro y luego analizados. No se encontró diferencias en tasas de maduración y tasas de fecundación comparando los grupos A y B. Sin embargo, las tasas de IVM fueron estadísticamente significativamente mayores en los grupos A y B en comparación del grupo C. No se encontró diferencias en tasas de fecundación entre los medios, pero la capacidad de desarrollo a estadio de blastocito fue significativamente mayor en el grupo B comparado con el grupo C. Conclusión(es): La capacidad de desarrollo de ovocitos inmaduros no difirió entre el medio de IVM convencional y el medio de cultivo para blastocitos, pero TCM-199 fue inadecuado. La evidencia obtenida tras la utilización de ratones como sujetos de estudio sugiere que tanto el medio IVM convencional como el medio de cultivo para blastocitos son aptos para IVM, y que el medio de cultivo para blastocitos puede ser una buena opción para IVM convencional de ovocitos inmaduros.

Objective: To compare three different in vitro maturation (IVM) media for immature oocytes. Design: Experimental study. Setting: In vitro fertilization laboratory. Animal(s): BDF1 female and male mice. Intervention(s): Retrieval and maturation of cumulus-enclosed germinal vesicle–stage oocytes according to one of three protocols: group A, conventional IVM medium; group B, blastocyst culture medium; and group C, tissue culture medium (TCM) 199. Main Outcome Measure(s): Maturation, fertilization, and developmental rates of immature oocytes. Result(s): A total of 653 immature oocytes were cultured in vitro and then analyzed. No difference was found in maturation rates and fertilization rates in comparing groups A and B. However, the IVM rates were statistically significantly increased in groups A and B compared with group C. No difference was found in fertilization rates between media, but the developmental competency to blastocyst stage was statistically significantly higher in group B compared with group C. Conclusion(s): The developmental competency of immature oocytes did not differ between conventional IVM medium and blastocyst culture medium, but TCM-199 was found to be unsuitable. Evidence from mice as test subjects suggests that both conventional IVM medium and blastocyst culture medium are suitable for IVM, and that blastocyst culture medium may be a good choice for conventional IVM of immature oocytes.
Autores:
Miran Kim, M.D.
Ph.D.,a Sun Jung Hong, M.Sc.,a Jae Hoon Lee, M.Sc.,a,b Churl K. Min, Ph.D.,b Kyung Joo Hwang, M.D., Ph.D.,a and Rae Woong Park, M.D., Ph.D.c a Department of Obstetrics and Gynecology, Ajou University School of Medicine, b Department of Biological Science, College of Natural Science, Ajou University, and c Department of Biomedical Informatics, Ajou University School of Medicine, Suwon, South Korea.
Cita:
(Fertil Steril® 2011;95:554–7. ©2011 by American Society for Reproductive Medicine. Traducción: Rev Iberoam Fert Rep Hum, 2011, 28: 81-87. ©2011 Revista Iberoamericana de Fertilidad y Reproducción Humana).


La maduración in Vitro (IVM) de ovocitos inmaduros obtenida de pequeños folículos antrales es una técnica prometedora para tratamientos de infertilidad o preservación de la fertilidad. A pesar de que han nacido más de 1,000 niños sanos gracias al proceso de IVM a partir de 2008 (1, 2), sólo pocos hospitales practican esta técnica. Muchos ensayos han intentado mejorar las tasas de maduración de ovocitos y desarrollo embrionario. Un estudio demostró un efecto beneficioso incrementado utilizando retinoides para el desarrollo embrionario en cabras (3). El medio de maduración tanto para humanos como para animales es usualmente suplementado con varios tipos de proteínas como suero bovino fetal, suero de cordón fetal, o suero materno. Se cree que estos sueros contienen albúmina y otros constituyentes desconocidos que ayudan a la maduración de ovocitos inmaduros. Aunque se han utilizado diferentes tipos de proteínas, todos los estudios han tenido resultados comparables (4).



 



Una variedad de medios de cultivo están disponibles, y la elección de medio de base para IVM es considerado particularmente difícil. Actualmente, el medio de cultivo más comúnmente utilizado para IVM es el medio IVM convencional. Los medios IVM comercializados como el MediCult (Origio A/S, Jyllnge, Dinamarca) y Sage (CooperSurgical, Trumbull, CT) han demostrado razonables tasas de fecundación, implantación, y embarazo clínico (5, 6). Durante IVM, es importante que el medio de cultivo provea a los ovocitos metabolitos enérgicos para la vía glucolítica, como piruvato y adenosintrifosfato (ATP) (7). Bajo este concepto, la suplementación con piruvato resultó ser esencial para el medio de cultivo para blastocitos y para tejidos 199 (TCM-199).



 



Los tres medios parecen ser válidos para el uso de cultivo in Vitro de ovocitos inmaduros. Nuestro estudio comparó la capacidad de maduración, fecundación, y desarrollo de ovocitos inmaduros de ratones después de cultivo in Vitro con los tres medios de cultivo.



 



MATERIALES Y MÉTODOS



Los protocolos experimentales y procedimientos de manejo de animales fueron evaluados y aprobados por el Comité de Ética animal de la Universidad Ajou. Los ovocitos obtenidos de ratones hembras BDFI de 6 a 8 semanas de edad (Orient Bio, Sungnam, Corea del Sur) criadas en las colonias de investigación de los investigadores en el laboratorio de animales. Los ovocitos en estadio de Vesícula Germinal (VG) para IVM fueron obtenidos de los grandes folículos antrales 48 horas después de que los ratones recibieran una inyección intraperitoneal de 5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Los ratones fueron sacrificados 48 hs después mediante dislocación.





Maduración in Vitro, Fecundación y Desarrollo



Los complejos ovocitos-cumulus con un cumulus oophorus ajustado y no expandido, y un ovocito en estadio de VG fueron seleccionados para IVM. La IVM, fecundación, y desarrollo embrionario fueron llevados a cabo de la siguiente manera. Los ovocitos obtenidos fueron lavados con fluido tubárico humano (HTF)-N-(2-hidroxietilo) piperazina –N’-(2-ácido etanol) (HEPES; Irvine Scientific, Santa Ana, CA) para eliminar sangre y detritos. Los ovocitos en estadio de VG rodeados de cumulus fueron extraídos y madurados de acuerdo a los protocolos: grupo A = medio IVM convencional (Sage, CooperSurgical); grupo B = medio de cultivo para blastocitos (BMI, Suwon, Corea del Sur); y grupo C = TCM-199 (Sigma). Los ovocitos inmaduros fueron randomizados y asignados a placas que contenían 1 mL de cada medio de cultivo. Todos los medios fueron suplementados con 10% de suero sintético substitutivo (SSS; Irvine Scientific, Santa Ana, CA), y gonadotropina menopáusica humana (0.075 UI/mL, IVF-M; LG, Seúl, Corea del Sur). Todos los medios fueron también suplementados con piruvato (22 mg/mL), estreptomicina (0.06 mg/mL), y penicilina (0.06 mg/mL).



 



Las placas fueron luego incubadas en atmósfera humidificada a 5% de CO2, y a 37ºC. Después de 24 horas de cultivo, todos los complejos cumulus-ovocito rodeando los ovocitos fueron separados con solución hialuronidasa (H 4272 tipo IV-S; Sigma) a una dilución de 80 UI/mL por un máximo de 30 segundos y luego lavado con fluido tubárico humano (HTF) suplementado con 10% de SSS. Los ovocitos maduros fueron determinados por la presencia del primer corpúsculo polar.



Los espermatozoides fueron extraídos del epidídimo caudal de ratones machos de 6 a 8 semanas de edad BDFI (Orient Bio), y la suspensión espermática fue pre incubada por 1.5 horas en medio de capacitación (CooperSurgical/Sage). Los ovocitos maduros fueron luego inseminados por espermatozoides de la dilución final de 2 x 106/mL e incubados a 37ºC en aire humidificado y a 5% de CO2. Los ovocitos inseminados fueron lavados de los espermatozoides restantes por pipeteo 6 horas después, y luego colocados en uno de los tres medios distintos.



 



Después de la inseminación, los ovocitos fueron cultivados individualmente en 25 mL de HTF suplementado con 10% de SSS y evaluado 16 a 18 horas más tarde. Se consideró fecundación normal cuando se identificaron dos pronúcleos. Después de la fecundación, evaluamos el desarrollo embrionario resultante por 5 días. Nosotros analizamos las tasas de maduración ovocitaria, fecundación y desarrollo de estadio de blastocito.



Análisis estadístico



Los datos recolectados de las tasas de maduración ovocitaria y fecundación fueron analizados por el análisis chi-cuadrado de Pearson. P<.05 fue considerado como estadísticamente significativo.



 



RESULTADOS



Un total de 505 ovocitos inmaduros (grupo A: 230, grupo B; 223; y grupo C: 200) fueron cultivados in vitro y luego analizados. Las tasas de maduración (121 de 230, 52.6%; 115 de 223, 51.6%; y 78 de 200, 39.0%, respectivamente) por ovocito inmaduro obtenido fue estadísticamente mayor en los grupos A y B que en el grupo C. Las tasas de fecundación (61 de 121, 50.4%, 68 de 115, 59.1%; y 37 de 78, 47.4%, respectivamente) por ovocito madurado no fue diferente entre los tres medios de cultivo. Las tasas de desarrollo a estadio de blastocito (3 de 61, 4.9%; 10 de 68, 14.7%; y 1 de 37, 2.7%, respectivamente) fue estadísticamente significativamente mayor en el grupo B que en el grupo C (Tabla 1). Nuestro estudio demostró que el medio de cultivo para blastocitos tiene un efecto comparable o incluso superior en capacidad de maduración y desarrollo a estadio de blastocito de ovocitos inmaduros en condiciones in Vitro.





DISCUSIÓN



Nuestro estudio demostró que el medio de cultivo para blastocitos y el medio IVM convencional tienen un efecto superior en el modelo ratón para maduración de ovocitos inmaduros, fecundación, y subsecuente desarrollo embrionario comparado con TCM-199. Desde el primer reporte de maduración meiótica espontánea sin gonadotropinas de ovocitos de mamíferos in vitro (8), los éxitos del desarrollo en modelos animales ha presentado a los médicos la posibilidad de utilizar ovocitos madurados in vitro (9). En virtud de estos esfuerzos, IVM de ovocitos humanos se hizo posible. Hasta ahora, solo el medio IVM convencional ha sido ampliamente usado. Sin embargo, debido a pocos ensayos de IVM y restricciones de financiación lo indican, se necesitan medios de cultivo para IVM más accesibles y económicos.



 



Nosotros comparamos la formulación de los diferentes medios (Tabla 2). De acuerdo a este análisis, solo taurina y lactato cálcico fueron los únicos componentes que estaban presentes en medio de cultivo para blastocitos pero no en los otros dos medios. Taurina, el cual es un ácido β-amino, actúa como un antioxidante in vivo en el fluido tubárico. Grandes cantidades de taurina e hipotaurina están presentes en gametos y en el ambiente embrionario en todas las especies reportadas hasta hoy. El efecto beneficioso de suplementar el medio de cultivo con taurina en el desarrollo embrionario in vitro ha sido reportado en varias especies, incluyendo el ratón (10), vaca (11, 12), y conejo (13). Ha sido demostrado que enriqueciendo el medio de cultivo con taurina y melatonina puede mejorar la maduración meiótica del ovocito in vitro y el desarrollo embrionario (14). El estrés oxidativo parece jugar un rol mayor en disminuir el desarrollo embrionario in vitro en mamíferos, y varios mecanismos de defensa están presentes en el desarrollo embrionario de mamíferos. In vivo, hipotaurina y taurina son sintetizadas y secretadas por las células epiteliales de la trompa. La hipotaurina puede neutralizar los radicales hidroxilos y prevenir la peroxidación lipídica. El subproducto de hipotaurina, después de neutralizar los radicales libres, es la taurina. Taurina tiene efectos antioxidantes indirectos. Un estudio propuso que las células somáticas podrían secretar factores embriotroóficos y podrían disminuir el daño causado por el oxígeno (15). Nosotros consideramos que el medio de cultivo para blastocitos, el cual contiene taurina podría tener un efecto superior en ovocitos inmaduros en maduración in Vitro y en el desarrollo a estadio de blastocito gracias al efecto de neutralización de radicales libres.



 



Los cambios nucleares durante la maduración ovocitaria y fecundación están coordinados con movimientos de organelas para asegurar un desarrollo embrionario normal. Los cambios citoplasmáticos ocurren, y la mitocondria conlleva una translocación intracelular compleja estadio-específica que parece ser un paso crítico para el desarrollo subsecuente (16, 17). Durante la maduración ovocitaria y fecundación, cambios dramáticos de la distribución mitocondrial ocurre con el objetivo de llevar a la mitocondria a la región de la célula donde se necesita mayor fuente de energía, como ATP (18) o liberación de calcio (19). Nosotros previamente reportamos el rol de ATP extracelular como un inductor de muerte celular apoptótica en células de la granulosa humanas y que el tratamiento con gonadotropina coriónica humana (hCG) eliminó tanto la despolarización mitocondrial inducida por ATP como la apoptosis (20). En el estudio previo, el tipo de receptor que se une a ATP, y así la mediación de apoptosis inducida por ATP, según lo determinado usando imagen de calcio y técnicas de patch-clamp. Un estudio evaluó la organización mitocondrial en ovocitos de cabras prepúberes cultivados con lactato cálcico durante IVM y fecundación (21). La acumulación de mitocondrias en el área perinuclear indicó que la oposición pronuclear y singamia puede requerir altas concentraciones de ATP o calcio libre. La distribución anormal y asimétrica mitocondrial alrededor del pronúcleo puede directamente afectar la distribución mitocondrial en las células hijas, produciendo de ese modo blastómeas con un número incompleto de mitocondrias que tienen baja producción de energía (17). Aunque el mecanismo preciso es desconocido, el medio de cultivo para blastocitos, el cual contiene lactato cálcico puede afectar positivamente la función mitocondrial para obtener suficiente producción de ATP.



 



Algunos investigadores demostraron que no hay diferencias entre el medio TCM-199 y el medio IVM convencional (6, 22). Sin embargo, nuestros resultados indican que el medio de cultivo para blastocitos es superior a TCM-199. No podemos explicar precisamente este fenómeno, pero fuimos capaces de duplicar estos resultados. Estudios futuros sobre ovocitos inmaduros humanos están en camino, y esperamos tener datos humanos prospectivamente.



El suplemento o reemplazo del medio de cultivo estándar parece ser necesario para optimizar la maduración de ovocitos inmaduros. El factor de crecimiento epidérmico, gonadotropinas, y aminoácidos esenciales y no esenciales fueron usados para optimizar la maduración de ovocitos porcinos (23, 24). Para la maduración de ovocitos humanos, se añadieron gonadotropina menopáusica humana, gonadotropina sérica de yeguas preñadas, hormona folículo estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH), ácido pirúvico, estradiol (E2), FSH recombinante, insulina, transferrina, y selenio al medio IVM (25-27). Varias proteínas indefinidas, como el suero bovino fetal, suero materno humano, suero humano sintético, y fluido folicular y peritoneal humano han sido también usados como suplemento de medios de maduración (28-30). De todos ellos, ninguno ha sido recomendado por todos los investigadores, y se necesitan estudios futuros para comprobar los mecanismos de maduración ovocitaria in Vitro.



 



La mayoría de los estudios en animales preceden a los ensayos en humanos. Los estudios para optimizar las condiciones de cultivo para ovocitos y desarrollo embrionario usando modelos animales son limitados por la disponibilidad de investigadores y el hecho de que el mecanismo exacto de maduración de ovocitos inmaduros por sí mismo es desconocido. No obstante, clínicamente este resultado indica que el medio de cultivo para blastocitos puede ser una buena alternativa al medio de cultivo IVM.


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Referencias bibliográficas:

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