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Correlación entre los parámetros seminales y fragmentación del ADN espermático en varones atendidos en un centro de fertilidad

Objetivo: Determinar la correlación entre los parámetros seminales (concentración, movilidad, morfología y vitalidad) y la integridad del ADN espermático, utilizando el test Halosperm. Material y métodos: Estudio prospectivo realizado en el Laboratorio de Andrología del Laboratorio de Reproducción Asistida FERTILAB, Lima – Perú, desde el mes de Agosto del 2012 al mes de  Marzo del 2013. Se evaluaron 282 pacientes. Se determinó el Índice de Fragmentación de ADN (IFA) espermático correspondiente a los pacientes  con muestra seminal normozoospermica y pacientes con muestra seminal alterado en algún parámetro seminal. Se utilizaron dos puntos de corte de IFA (18% y 30%) y se correlacionaron con los parámetros seminales. En la población total se determinó la correlación de Spearman entre edad, los parámetros seminales y el IFA. Resultados: Se determinó que el valor de la mediana de IFA de los varones con muestra seminal normozoospermica era significativamente menor que el de los varones con muestra seminal alterado en algún parámetro (12,8% vs 19,0, P=0,000). Utilizando el punto de corte de 18% se encontró que existe diferencia significativa en las medianas entre los dos grupos (Grupo 1: ≤ 18% y Grupo 2: > 18%) en la edad (37años vs 40 años, P=0,002), concentración espermática (82,30 x 106/ml vs 58,00 x 106/ml, P=0,046),  movilidad progresiva (45,80% vs 27,40, P=0,000), morfología normal (12,50% vs 9,00%, P=0,000) y vitalidad espermática (89,0% vs 78,0%, P=0.000). Al utilizar el punto de corte de 30% se encontró diferencia significativa entre los dos grupos (Grupo 1: ≤ 30% y Grupo 2: > 30%) en la edad (39 años vs 44 años, P=0,000), en la concentración espermática (78,00 x 106/ml vs 36,75 x 106/ml, P=0,015), movilidad progresiva (40,85% vs 22,38%, P=0,000), morfología normal (12,0% vs 6,0%, P=0,004) y vitalidad espermática (85% vs 72,5%, P=0.000).  También se demostró una correlación inversa entre el IFA y  los parámetros de concentración (r=- 0,219 P=0,000), movilidad progresiva (r=-0,452 P=0,000), morfología normal (r=-0,322 P=0,000)  y vitalidad (r=-0,452 P=0,000) en la población total. Se determino una correlación positiva significativa entre la edad y el IFA (0,267 P= 0.000). Conclusiones: Los resultados indican que el daño a nivel de ADN espermático en pacientes con muestra seminal alterado en algún parámetro es significativamente alto comparado al de los pacientes con muestra seminal normozoospermica. Se ha demostrado que los parámetros seminales (concentración, movilidad, morfología y vitalidad) están altamente correlacionados negativamente con el índice de fragmentación del ADN espermático. Se demostró una correlación positiva entre la edad y el IFA.

Objetive: To determine the correlation between the semen parameters (concentration, motility, morphology and vitality) and sperm DNA integrity, using the test Halosperm. Material And Methods: Prospective study conducted at the Laboratory of Andrology of Assisted Reproduction Laboratory FERTILAB, Lima - Peru, from August 2012 to March 2013. 282 patients were analyzed. We have established the DNA fragmentation index (IFA) from patients with semen sample normozoospermic and patients with semen sample altered in some parameters. We used two types of threshold (18% and 30%) and were correlated with semen parameters. In the total population was determined the Spearman correlation between sperm parameters and the IFA. Results: It was determined that the value of the median the IFA of the patients with semen sample normozoospermic was significantly lower than that patients with semen sample altered in some parameters (12.8% vs 19.0, P=0.000). Using threshold of 18% was determined the there significant difference between the median of the two groups (Group 1: ≤ 18% y Group 2:> 18%)  in age (37 years vs 40 years, P=0.002), sperm concentration (82.30 x 106/ml vs 58.00 x 106/ml, P=0.046), progressive motility (45.80% vs 27.40, P=0.000), normal morphology (12.50% vs 9.00%, P=0.000) and sperm vitality (89.0% vs 78.0%, P=0.000). Using the threshold of 30 % was found significant difference between the median of the two groups (Group 1: ≤ 30% y Group 2:> 30%)  in age (39 years vs 44 years, P=0.000), sperm concentration ( 78.00 x 106/ml vs. 36.75  x 106/ml, P=0.015 ) , motility progressive (40.85% vs 22.38 %, P=0.000 ) , normal morphology (12.0 % vs 6.0 %, P=0.004) and sperm vitality (85.0 % vs 72.5%, P=0.000). Also identified an inverse correlation between the IFA and concentration (r=- 0.219 P=0.000), progressive motility (r=-0.452 P=0.000), normal morphology (r=-0.322 P=0.000) and vitality (r = -0.452 P = 0.000) in the total population. We determined a significant positive correlation between age and the IFA (r=0.267 P = 0.000). Conclusions: The results indicate that the level of DNA damage in sperm patients with semen sample altered in some parameters is significantly higher than in patients with semen sample normozoospermic. It has been shown that the semen parameters (concentration, motility, morphology and vitality) are highly negatively correlated with sperm DNA fragmentation index. It showed a positive correlation between age and the IFA
Autores:
Láyonal Germán Acosta Campos
Láyonal Germán Acosta Campos1, Julio Cesar Dueñas Chacón1, 2 1 Laboratorio de Andrología, Laboratorio de Reproducción Asistida FERTILAB, Lima - Perú 2 Clínica de Fertilidad PROCREAR, Lima – Perú
Cita:
( Rev. Iberoam. Fert Rep Hum, 2014; 31; 44-52 © Revista Iberoamericana de Fertilidad y Reproducción Humana)


INTRODUCCIÓN



Actualmente se ha determinado que alrededor del 10 – 15% de las parejas en edad reproductiva presentan problemas de fertilidad a nivel mundial (1). Se estima que el factor masculino está comprometido en aproximadamente un 50% de estos casos (2), por lo que no queda duda de la importancia de la evaluación de las características del semen en el diagnóstico de fertilidad. El espermatograma es utilizado frecuentemente en la mayoría de los centros de fertilidad como única prueba de diagnóstico de fertilidad masculina. Este análisis incluye la evaluación de  volumen y pH del semen así como la  concentración, movilidad, morfología y vitalidad de los espermatozoides de acuerdo a los criterios de la Organización Mundial de la Salud (3). Sin embargo, se estima que de los varones infértiles aproximadamente un 10 -15% presentan el análisis del semen dentro de los parámetros normales (4). Se ha determinado que la capacidad de fertilización del espermatozoide no solo depende de la competencia funcional de éste sino también de la integridad del ADN espermático (5-7). Es por ello que es indispensable establecer otras pruebas de diagnóstico que se utilicen de rutina y complementarias al espermatograma, como la determinación del índice de fragmentación de ADN espermático para medir la integridad del ADN (8-10).

La fragmentación del ADN espermático puede ser inducida por apoptosis durante el proceso de espermatogénesis en el epitelio de los túbulos seminíferos, por roturas en las cadenas de ADN producidas durante la remodelación de la cromatina espermática en la espermiogénesis, por las especies reactivas de oxigeno  (ROS) durante el transporte del espermatozoide de los túbulos seminíferos al epidídimo, por la inducción de caspasas endógenas y endonucleasas, por daño inducido por quimioterapia, radioterapia y tóxicos ambientales (11).

Una amplia serie de estudios que han determinado la correlación entre el daño del ADN espermático y los parámetros seminales en diferentes poblaciones y utilizando diferentes ensayos (12-23), sin embargo también existen estudios que no han determinado ninguna correlación (24, 25). Así mismo un alto índice de fragmentación del ADN espermático se ha relacionado negativamente con la fertilidad, con el desarrollo embrionario (26) y con una baja tasa de formación de blastocistos y de embarazo tras la fertilización In Vitro (FIV) e inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) (27-33).

Varios tests se han desarrollado para evaluar los niveles de daño de ADN espermático: test TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling), test ensayo cometa, test DBD – FISH (Breakage Deteccion-Fluoresecence In Situ Hibridization), test CMA3 (Chromomycin A3), test Naranja de Acridina, SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) y el test SCD (Sperm Chromatin Dispersion) (34-40). Halosperm es un test SCD nuevo, mejorado, económico y simple que se basa en la descondensación diferencial de la cromatina en aquellos espermatozoides que tienen su ADN fragmentado respecto aquellos que no lo tienen. Los espermatozoides  con fragmentación no producen halo de dispersión de la cromatina mientras que los que no están fragmentados  dan lugar a grandes halos (41).

El objetivo de este estudio es determinar la correlación entre los parámetros seminales evaluados en el espermatograma (concentración, movilidad, morfología y vitalidad) y la integridad del ADN espermático utilizando el test Halosperm.

 



MATERIAL Y MÉTODOS



Pacientes

Se evaluaron a 282 pacientes con sospecha de infertilidad que asistieron al Laboratorio de Andrología del Laboratorio de Reproducción Asistida FERTILAB, Lima – Perú durante los meses de Agosto 2012 a Marzo 2013. Los criterios de exclusión fueron: pacientes que presentaron una concentración menor a 1 millón de espermatozoides/ml y azoospermia, atrofia testicular, criptorquidia, tratamientos con antibióticos o antioxidantes, diabetes, historia de quimioterapia y radioterapia, enfermedades crónicas. Este estudio siguió las recomendaciones y fue aprobado por el comité de bioética de PROCREAR.

 



Colección seminal y Espermatograma

Las muestras fueron obtenidas por masturbación, después de 3 a 7 días de abstinencia sexual y se recogieron en contenedores estériles. Luego, estas muestras fueron rotuladas y colocadas en la incubadora a 37°C por 30 – 60  minutos para que ocurra la licuefacción completa y proceder a su análisis. El análisis de la movilidad progresiva y la morfología espermática (coloración Papanicolaou y criterios de Kruger) se han efectuado mediante el analizador Sperm Class Analizer (SCA), un equipo automatizado de análisis de semen tipo CASA. La concentración espermática fue determinando utilizando la cámara de Neubauer®  y la vitalidad mediante tinción eosina Y, ambos siguiendo las recomendaciones de la OMS (3). Los valores límites inferiores de referencia  que hemos seguido para clasificar a los pacientes con muestra seminal normozoospermica (NORMO) y con alguna alteración en los parámetros seminales (ALTERADO) son los establecidos por la OMS como  la concentración (≥ 15 millones espermatozoides/ml), movilidad progresiva (≥ 32,0%), morfología espermática (≥ 4,0% de espermatozoides normales) y vitalidad espermática (≥58,0% de vivos).

 



Fragmentación del ADN espermático: test Halosperm (SCD, Dispersión de la cromatina del espermatozoide)

Se utilizo el test Halosperm  con modificaciones menores para evaluar el índice de fragmentación de ADN (Halotech DNA SL, Madrid, España) (41, 42). Una alícuota de cada muestra seminal fue homogenizado en 5 ml de PBS (Suero fosfato bovino), luego fue centrifugado a 1500 rpm por 7 minutos. Se recupero el pellet y fue diluido en PBS hasta alcanzar una concentración de 5 – 10 millones de espermatozoides/ml. El eppendorf con agarosa (bajo punto de fusión) fue incubado por 5 minutos a 90 – 100°C, luego fue colocado en baño maría a 37°C por 5 minutos, posteriormente se le adicionó 20µl de semen diluido y se homogenizo.  Se colocaron 10µl del homogenizado sobre una lámina portaobjeto pre tratada con agarosa (normal punto de fusión) y fue cubierta con lámina cubreobjeto de 22 x 22 mm. Las laminas fueron colocadas en refrigeración a 4°C por 7 minutos, luego se retiró el cubreobjeto con cuidado y se le adicionó la solución ácida (80µl HCl en 10 ml de agua destilada) por 7 minutos. Se retiro la solución ácida y se colocó la solución lisis por 25 minutos. Se eliminó la solución lisis y la lámina portaobjeto fue colocado en agua destilada y etanol de 70, 90 y 100 por 2 minutos cada uno. Se deja secar a temperatura ambiente y finalmente es teñida con el colorante Wright. Se analizaron 500 espermatozoides por cada lámina para determinar el índice de fragmentación de ADN (IFA).

Se evaluaron dos puntos de cortes:

- 18%: Grupo 1 (IFA  ≤ 18%) y Grupo 2 (IFA>18%) (43) y

- 30%: Grupo 1 (IFA ≤ 30%) y Grupo 2 (IFA> 30%) (23, 34)

 



Análisis estadístico

Los resultados fueron analizados mediante el software SPSS 21.0 para Windows. Debido a que los parámetros e IFA presentan una distribución no normal, los percentiles 25 – 75, la mediana, media y deviación estándar fueron calculados. La información en los diferentes grupos fueron comparados por Mann – Whitney (test no paramétricos) y test de la mediana. La correlación entre el IFA y los parámetros seminales se determinó mediante el coeficiente de correlación de Spearman.

 



RESULTADOS



La mediana de la edad, parámetros seminales e IFA entre los pacientes con muestra seminal normozoospermica(NORMO) y con alteración en algún parámetro seminal (ALTERADO) son resumidos en la tabla 1. No se encontró diferencias significativas en la edad entre los dos grupos. Se encontró diferencias significativas en la concentración, movilidad progresiva, morfología normal y vitalidad entre los dos grupos.

Se determino la existencia de diferencias significativas en la edad y parámetros seminales entre los dos grupos formados en los puntos de corte de 18% (Tabla 2) y 30% (Tabla 3).

El análisis de la correlación de Spearman indico que en la población total: la edad  (r=0,267, P=0,000) presenta una correlación positiva significativa con el IFA. La concentración espermática (r= -0,219, P=0,000), el porcentaje de movilidad progresiva (r=-0,452, P= 0,00), el porcentaje de espermatozoides normales  (r=-0,322 P=0,000) y el porcentaje de vitalidad  (r=-0,452 P=0,000) presentan una correlación negativa significativa con IFA (Figura 1 A - E).





 





 





 



DISCUSIÓN



El espermatograma no nos brinda una real predicción del potencial fecundante del espermatozoide y no siempre es capaz de explicar la causa de infertilidad masculina, es por ello que diversos autores han recomendado la introducción del análisis de la fragmentación del ADN espermático como prueba de rutina y complementaria en el análisis del semen (8-10).  Diferentes estudios se han desarrollado para evaluar el daño del ADN espermático y obtener información sobre la competencia espermática (34-40). Nosotros utilizamos el test Halosperm (41, 42), un método simple, altamente sensible (44) que en los últimos años ha sido incorporado en los laboratorios como método  para determinar la capacidad reproductiva del espermatozoide y su correlación con los parámetros seminales (10, 23, 34, 43 - 45). En nuestro estudio utilizamos dos puntos de corte para el valor de IFA, el valor de 18%, porque se determinó mediante el test Halosperm que valores menores al mismo tenían una correlación  significativa sobre la predicción de la fertilización del ovocito tras FIV o ICSI (43) y el valor de 30% que mediante la misma técnica se evaluó los parámetros seminales y la tasa de fertilización (23, 34).

Los resultados presentados en este estudio confirma la evidencia de que los varones infértiles están asociados con una pobre integridad del ADN espermático (Tabla 1), tal como se demostró en algunos estudios utilizando el test Halosperm (41), ensayo cometa (7),  TUNEL (46) y correlacionando los test Halosperm, SCSA y TUNEL (47).

En nuestro estudio, hemos comparado dos puntos de corte del IFA, de manera que al analizar el punto de corte de 18% (Tabla 2), se determino que aquellos pacientes que presentaban IFA mayores a 18% en relación a la mediana de la  edad, concentración espermática, movilidad progresiva, morfología y vitalidad son menores en comparación a los pacientes que presentan valores de IFA menores a 18%.  Caso similar ocurre al utilizar el punto de corte de 30% (Tabla 3). Nuestro estudio  difiere del estudio de Tandara et al., que utilizando el punto de corte de 30% y el mismo test Halosperm no encontró diferencia significativa en la concentración espermática (23), mientras que Yilmaz et al., utilizando las mismas consideraciones sólo encontró diferencia significativa en la concentración espermática (34).  En la evaluación de la población total se encontró una correlación negativa entre los parámetros seminales (concentración, movilidad, morfología y vitalidad) y el IFA, tal como se demostró en otros estudios utilizando la misma técnica (43). Tandara et al., no encontró una correlación significativa entre la concentración y el IFA (23). La existencia de variación en las correlaciones de los parámetros seminales y IFA obtenidos en los diferentes estudios puede deberse por la falta de criterios en la selección de los pacientes (23).

El aumento de daño a nivel de ADN espermático puede ser producido por diferentes causas como las encontradas principalmente por estrés oxidativo, por  una condensación anormal de la cromatina del espermatozoide, por un proceso de apoptosis y  por la reducción de antioxidantes en el semen (48-52). La reducción de la concentración espermática en los valores altos del IFA puede indicar la presencia de un proceso apoptótico en las muestras de semen (34), así mismo estudios sugieren que los parámetros seminales (movilidad, morfología y vitalidad) disminuyen mientras aumenta el daño a nivel de ADN y presentan una correlación negativa entre el IFA debido a que los espermatozoides inmóviles, anormales y muertos producen un  elevado nivel de especies  reactivas de oxigeno (ROS). Los niveles altos de ROS en el plasma seminal aumentan el daño del ADN espermático (6, 51, 52).

Se ha determinado que con la edad pueden ocurrir cambios en el sistema reproductor masculino tales como en las funciones de los testículos, producción de hormonas sexuales, calidad seminal, fertilidad y daños en el ADN espermático (53). Nosotros encontramos una correlación significativa positiva entre la edad y el IFA (Figura 1A). Nuestros datos son concordantes a los obtenidos por Singh et al., usando ensayo cometa (54), Wyrobek et al., usando el test SCSA (55), Vagnini et al., usando test TUNEL (56) y Horta et al., usando el test TUNEL y Halosperm (57). Paul et al., demostraron que el daño en el ADN espermático a nivel testicular en correlación con la edad era producido por estrés oxidativo (58).

En conclusión,  nuestros resultados han establecido que el IFA presenta una correlación negativa con los parámetros seminales y una correlación positiva con la edad, por lo tanto, el daño a nivel del ADN espermático es importante en el estudio de la infertilidad masculina y debe ser considerado  su análisis como una prueba de rutina en el estudio seminal. El test Halosperm ha demostrado ser un estudio simple y rápido  para la evaluación de la fragmentación del ADN espermático y puede ser aplicado como un test de rutina en los laboratorios de andrología.


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