Aplicación del diagnóstico genético preimplantacional en la distrofia miotónica tipo 1 o enfermedad de Steinert

INTRODUCCIÓN

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es la distrofia muscular de aparición en la edad adulta más frecuente, que cursa con una prevalencia aproximada de 1/20.000 personas. Está causada por la expansión de una repetición de trinucleótidos CTG en la región 3’ no codificante del gen DMPK localizado en el locus 19q13.3 (1-4), y que se expresa en los músculos esqueléticos. Es un trastorno multisistémico con afectación de de órganos y sistemas diferentes, con aparición de tres fenotipos algo solapantes que, generalmente, se correlacionan directamente con el número de repeticiones CTG (6): DM1 leve (abarca un número de repeticiones CTG entre 50 y 150), DM1 clásica (número de repeticiones CTG comprendido entre 100 y 1000) y DM1 congénita (cuando el número de repeticiones CTG es mayor a 1000 copias), siendo éste el fenotipo más grave con aparición más temprana (5). Se caracteriza por: debilidad severa generalizada, hipotonía infantil, deficiencias respiratorias, discapacidad intelectual y sintomatología propia de las formas clásicas en el adulto (debilidad, miotonía, cataratas, alopecias y arritmias cardiacas). La insuficiencia cardiaca es una causa de muerte frecuente.

Además de la gran variabilidad de síntomas y grado de severidad de éstos, parte de su importancia es debido a la existencia de la forma de DM1 congénita severa, lo que hace más urgente la necesidad de encontrar diferentes aproximaciones para su control y prevención. Actualmente, la técnica de Diagnóstico Genético Preimplantacional se considera una de las mejores opciones reproductivas para aquellas parejas en las que alguno de sus progenitores es afecto de DM1 (7). Se conoce, por estudios anteriores, que el DGP en pacientes afectos de DM1 ofrece buenos resultados reproductivos, tanto en términos acumulativos como por ciclo de tratamiento (8).

En este estudio se evaluó la técnica de DGP en función del sexo del progenitor afecto y el número de repeticiones CTG y su influencia sobre el resultado reproductivo de la misma.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se realizó un estudio observacional retrospectivo transversal.

Pacientes. Desde 2012-2016 se llevaron a cabo 48 ciclos de Reproducción Asistida de DM1 en el programa de DGP de la Unidad de Reproducción Humana Asistida del Hospital Universitari i Politècnic La Fe, Valencia. Se incluyeron un total de 13 parejas. En 8 de éstas la afecta era la mujer y en las 5 restantes es el hombre fue el portador de la enfermedad.

 

Estudio previo. Incluyó las siguientes intervenciones:

Si el informe de valoración técnica y el EBE son favorables para la realización de la ICSI-DGP, se inicia el estudio de informatividad previo específico para la optimización del protocolo del análisis genético en cada caso (figura 1). Para cada una de las parejas, se llevó a cabo la extracción de 2 tubos de sangre de 5mL con EDTA tanto de cada uno de los miembros de la pareja como de algunos de sus familiares, dependiendo el caso.

Estudio de informatividad en parejas y familiares. El protocolo de análisis molecular fue optimizado en linfocitos aislados de la sangre periférica para cada familia. Los linfocitos se separaron por centrifugación y posteriormente fueron lavados en medio libre de Ca+2 / Mg+2 suplementado con BSA. Se recogieron las células individuales en un microscopio invertido y se transfirieron a un tubo de 0,2 mL sin nucleasas que contenía 3 μL de tampón de lisis y se incubaron a 65ºC durante 10 minutos.

 

Amplificación y detección de la expansión. En todos los casos, se realizó la TP-PCR para confirmar el estatus patológico de todos los familiares incluidos en el estudio. En concreto, se realizó un protocolo TP-PCR modificado, mTP-PCR, a nivel de célula única para permitir la amplificación de alelos DMPK no expandidos junto con la amplificación de la repetición CTG y la amplificación simultánea del marcador polimórfico enlazado, DS19S112, descrito anteriormente (9) (figura 2).

Detección selectiva de haplotipos: PCR multiplex. Para amplificar, simultáneamente, tanto el gen causante de la enfermedad, DMPK, como de los STR se llevó a cabo una PCR multiplex fluorescente, que permite conocer la fase (10). Se incluyeron los STR informativos en cada caso y se realizó la PCR multiplex siguiendo los protocolos basados en métodos previamente publicados (11) (figura 3).

Análisis de productos PCR. Los productos de ambas PCR se separaron mediante electroforesis capilar de 16 capilares en secuenciador automático AB3130XL (Applied Biosystems), mediante el método de secuenciación automática de Sanger durante 40 minutos.

Ciclo DGP. Se siguieron todos los pasos del ciclo DGP (figura 4) detallados a continuación.

Estimulación ovárica y recuperación de ovocitos. Para la estimulación ovárica se llevaron a cabo los mismos procedimientos que para una fecundación in vitro (FIV) convencional, dependiendo de las condiciones de cada mujer. La punción folicular para la recuperación de los ovocitos se realizó según el programa habitual de FIV, en quirófano y con anestesia. La captación ovocitaria se realizó mediante una punción transvaginal ecoguiada.

 

ICSI (Inyección Intracitoplasmática). Una vez obtenidos los líquidos foliculares, se trasladaron en tubos Falcon al laboratorio de Embriología, donde se aislaron los complejos cúmulo-corona-ovocito. Tras un periodo de incubación de 3-4 horas, se eliminaron las células de la granulosa que envuelven a cada óvulo a partir de un procedimiento enzimático mediante una serie de lavados en una solución de hialuronidasa.

El procesamiento de la muestra seminal de la pareja se realizó mediante la capacitación. Una vez se obtuvo la muestra de espermatozoides, se esperó 20-30 minutos para que la muestra licuara y se hicieron pasar por gradientes de densidad y, posterior centrifugación a 300g durante 20 minutos. Tras la obtención de los espermatozoides con buena movilidad y morfología, fueron lavados en medio de cultivo, sometidos a un nuevo ciclo de centrifugación a 500g durante 10 minutos y guardados para su posterior uso en la ICSI.

El proceso de la microinyección se realizó siguiendo el procedimiento previamente descrito (12). En primer lugar, se seleccionó aquel espermatozoide capacitado con mejor morfología y se inmovilizó para su activación. Tras esto, se introdujo en el interior del ovocito maduro fijado con el cuerpo polar a las seis o a las doce (figura 5). Este procedimiento se repitió tantas veces como ovocitos maduros en estadio metafase II haya. Tras 15-18 horas, se observaron los ovocitos para ver la existencia de fecundación. Los ovocitos fecundados se colocaron en el medio de cultivo hasta realizar la biopsia embrionaria y posterior transferencia al útero.

Biopsia embrionaria. Se realizó una biopsia de blastómeras (figura 6). Tras el cultivo embrionario hasta día +3 (72-74h post-punción folicular). Siguiendo las recomendaciones de la Sociedad Europea de Reproducción Humana, ESHRE, solo a los embriones con más de 6 células se les practicó la extracción de dos blastómeras; mientras que, en los embriones tuvieran un número menor de células se realizó la extracción de una única blastómera. Asímismo, embriones de menos de 5 células en día +3 de cultivo o con una fragmentación mayor del 40 % no se biopsiaron por ser embriones de baja calidad morfológica.

La biopsia embrionaria se realizó en un microscopio invertido con placa calefactada (tokai hit), el cual tiene asociados dos mandos hidráulicos de micromanipulación. La extracción de la blastómera se realizó mediante una pipeta de biopsia (Wallace, Keene, USA) asociada a un sistema de aspiración por boca. La rotura de la zona pelúcida se realizó mediante un disparo láser (Saturn Laser System). Una vez obtenidas las blastómeras se les sometió a un proceso de lisis celular mediante el uso de tampones alcalino(KOH 200mM o NaOH, DTT 50 mM) previamente añadidos a los tubos de PCR e incubación a 65ºC durante 10 minutos.

 

Diagnóstico genético en blastómeras. Se siguieron los mismos procedimientos descritos en el estudio de informatividad; es decir, detección de la expansión y de haplotipos a partir de una mTP-PCR y una PCR multiplex fluorescente respectivamente.

 

Transferencia de embriones y Crioconservación. Únicamente los preembriones libres de DM1 y que se hayan dividido normalmente en el cultivo in vitro fueron aceptados para la transferencia, realizada el día +5 post-extracción. Para cada uno de los casos se transfirieron uno o dos preembriones (nunca más de dos con el fin de evitar grandes gestaciones múltiples), según la disponibilidad y deseos de las parejas. La fase lútea fue suplementada con progesterona micronizada por vía vaginal. A los 15 días de la transferencia embrionaria, se realizó una extracción de sangre a la paciente para determinar los niveles de β-HCG y comprobar si el embrión había implantado.

En el caso de tener preembriones sanos supernumerarios o sobrantes se congelaron mediante el método de vitrificación para intentos posteriores.

 

Parámetros de resultado. Se obtuvieron los siguientes datos para todos los ciclos en las 13 parejas (tabla 1). Para el hombre se anotó la edad y el recuento de espermatozoides móviles tras la capacitación (REM). En el caso de la mujer, se obtuvieron datos sobre: edad, IMC, niveles de estradiol y grosor endometrial el día de la administración de hCG (E2-hCG y Edm-hCH) y número de ovocitos metafase II (mII) obtenidos. En cuanto al parental afecto de DM1 se registraron los datos sobre: sexo del progenitor afecto, número de repeticiones CTG y clasificación de la enfermedad, entendida como leve para aquellos pacientes con un número de repeticiones ≤ 150 y clásica para un número de repeticiones > 150. Para la variable número de repeticiones CTG faltaron los datos de 2 parejas, pero se mantuvieron para el análisis de las restantes variables.

También se registraron datos sobre: número de ciclos, número de embriones frescos, número de embriones congelados, número de embriones analizados, número de embriones sanos, número de embriones afectos y número de embriones sin diagnóstico para cada una de las parejas. Se calculó, a partir de estos datos, la tasa de fecundación por ovocito fecundado que llega a día +3 de desarrollo (definida como: número de embriones analizados/ número de ovocitos mII, expresada en porcentaje), número de ovocitos en fase mII por ciclo, tasa de embriones afectos (definida como: número de embriones afectos/ número de embriones analizados, expresada en porcentaje) y tasa de embriones sanos (definida como: número de embriones sanos/ número de embriones analizados, expresada en porcentaje). Además, en mujeres que consiguieron una gestación se tubo en cuenta las variables: aborto, parto, tipo de parto y sexo del recién nacido.

 

Análisis estadístico. El análisis de los datos se realizó a través del programa estadístico SPSS v.19. En todas las pruebas estadísticas realizadas con las variables de resultados se utilizó un nivel de significación estadística de 0,05. En primer lugar, se realizó un análisis no paramétrico usando el test de Kolmogorov-Smirnov para asegurarse de que la población sigue una distribución normal para todas las variables de estudio. Se llevó a cabo una comparación de medias mediante el test t-Student para las variables cuantitativas y Chi-cuadrado y tablas de contingencia para las variables categóricas, en ambos casos agrupando por sexo del progenitor afecto para la identificación de la posible relación entre variables. Para las variables con un tamaño muestral muy reducido, se realizó el test Mann-Whitney, para comparar las medianas. Para analizar si existe relación entre el sexo del progenitor afecto y las variables relacionadas con la capacidad reproductora se realizó una regresión lineal y el test Anova. El cálculo de probabilidades (probabilidad de embarazo y probabilidad de tener un hijo sano dependiendo del sexo del progenitor afecto) y la relación entre el número de repeticiones CTG, gestación y parto se realizó mediante una correlación bivariada.

RESULTADOS

Un total de 13 parejas fueron incluidas en el estudio por cumplir con los criterios de inclusión y ninguno de exclusión y realizaron el programa de DGP. De ellas, en 8 la mujer era afecta mientras que en las 5 restantes fue el hombre el portador de la enfermedad. Para poder clasificar a los progenitores afectos según la gravedad de la enfermedad, se utilizó el número de repeticiones CTG. De las 13 parejas, pudieron ser clasificadas 11 y, de éstas, solo de 8 pudieron conocerse el número exacto de repeticiones. Pese a esto, no se eliminaron las otras 5 para el resto de análisis. Se consiguieron 7 gestaciones, de las cuales se produjeron 2 abortos, en la semana 7 y 10 respectivamente, y 5 partos, entre la semana 36 y 41 de gestación, 3 de ellos vía vaginal y 2 por cesárea. Nacieron, en total, 3 niñas y 2 niños. Todos fueron remitidos para el estudio rutinario del pediatra y comprobar su estado de salud.

Parámetros de resultado en función del sexo del progenitor afecto. Para las 13 parejas se realizaron comparaciones dependiendo del sexo del progenitor afecto para todas las variables de interés (tabla 2). El estudio para la comparación de medias en ambos grupos se realizó mediante el test estadístico t-Student. Atendiendo a los resultados, se pudo determinar una relación significativa para la edad del hombre dependiendo de si el afecto de la pareja era él o la mujer (30,60 (4,22) vs. 36,13 (2,99) edad hombre; p = 0,018), siendo mayor la edad del hombre cuando fue su pareja la portadora de la enfermedad. A pesar del resultado no significativo, es interesante destacar la diferencia de la media en el número de embriones sanos en ambos grupos. En la muestra estudiada, el número de embriones sanos fue mayor cuando la mujer era la afecta en comparación con los casos en los que lo fue el hombre (4,88 (3,64) vs. 1,80 (1,64) nº embriones sanos; p = 0,107). Para el resto de parámetros, los resultados no mostraron diferencias significativas.

Estos resultados fueron validados mediante el análisis de comparación de medianas realizando la prueba U de Mann-Whitney. En este caso, tampoco se encontraron diferencias significativas en los rangos dependiendo del sexo del progenitor afecto que pudieran sugerir algún tipo de relación en ningún caso, excepto para la edad del hombre (tabla 3).

En cuanto a las variables categóricas, se realizó el test Chi-cuadrado para estudiar si existía una relación entre las variables (“clasificación del grado de distrofia del progenitor afecto”, “aborto”, “gestación” y “sexo del hijo”) y el sexo del progenitor afecto. Para ninguna de las variables analizadas se pudo establecer ninguna asociación significativa, asumiendo que el sexo del progenitor afecto no influye sobre éstas (tabla 4).

Parámetros de resultado en función de las repeticiones CTG. Al igual que en el caso anterior, se realizó el test t-Student para las variables cuantitativas (tablas 5 y 6). Únicamente se pudieron observar diferencias significativas en el número de repeticiones CTG dependiendo del tipo de DM1 (116,50 (47,38) vs. 321,83 (108,92) nº de repeticiones CTG; p = 0,048), lo que es evidente si tenemos en cuenta cómo hemos definido cada uno de los grupos.

Teniendo en cuenta el número total de embriones sanos y afectos analizados en función del grado de afectación del progenitor (tabla 6), se observó un incremento en el número de embriones afectos en aquellos casos donde el progenitor presentó DM1 clásica en comparación con las formas más leves de la enfermedad. Al realizar la prueba Chi-cuadrado se comprobó que el mayor número de embriones afectos para las formas clásicas de la enfermedad fue significativamente mayor, lo cual demostraría que existe una transmisión preferencial de los alelos expandidos (32,00 vs. 62,01 nº embriones sanos vs. nº embriones afectos para clasificación DM1 progenitor “clásica”; Χ2 = 9,44, p = 0,001). Esta asociación no fue dependiente del sexo del progenitor afecto. Para poder estudiar este último punto, se estratificaron los datos de la base en función del sexo del progenitor afecto y se repitió el test t-Student para las variables nombradas (“ovocitos mII”, “embriones sanos”, “embriones afectos”, “tasa de embriones sanos”, “tasa de embriones afectos” y “tasa de fecundación”) (tabla 8). Solo se pudo conseguir un caso de DM1 leve tanto en hombres como en mujeres, por lo que su comparación podría dar una idea en el caso de detectarse cierta tendencia, pero no serviría para obtener conclusiones claras.

Para el número de ovocitos en mII, solo fue significativa la diferencia en ambos grupos dentro de hombres afectos (22,00 (-) vs. 13,33 (1,53) ovocitos mII; p = 0,039) pero no para las mujeres afectas (21,00 (-) vs. 28,50 (14,50) ovocitos mII; p = 0,652). Esta relación carece de importancia, ya que el número de ovocitos en mII que se consigue en cada caso depende únicamente de la mujer y, para éstas, no hay diferencias significativas dependiendo de la gravedad de la enfermedad.

Para el número de embriones afectos se observó que, aunque sin diferencias significativas estadísticamente, en las parejas donde el hombre fue el afecto se observaron valores superiores para los casos de DM1 leve en comparación con las formas clásicas (11,00 (-) vs. 5,33 (1,53) nº embriones afectos; p = 0,085); mientras que para aquellas parejas donde la afecta fue la mujer, estos valores fueron ligeramente superiores para los casos de DM1 clásica frente a los casos de DM1 leve (4,00 (-) vs. 7,67 (4,72) no embriones afectos; p = 0,504). En cambio, para la tasa de embriones afectos solo encontramos diferencias para aquellas parejas en las cuales la portadora fue la mujer, siendo más elevada en los casos de DM1 clásica que para los casos leves (30,77 (-) vs. 66,71 (19,69) tasa embriones afectos; p = 0,152). Si tenemos en cuenta la variable “tasa de fecundación”, se puede hacer una distinción en función del sexo del progenitor afecto. De modo que, para las parejas en las cuales el afecto fue el hombre, se apreció un aumento en la tasa de fecundación en casos de DM1 clásica sobre casos leves (36,54 (-) vs. 63,16 (18,79) tasa fecundación; p = 0,345). Por el contrario, para mujeres afectas, se pudo apreciar una tasa mayor en casos de DM1 leves que para la forma clásica (61,90 (-) vs. 42,47 (16,14) tasa fecundación; p = 0,316) pero sin diferencias significativas.

Para las variables categóricas se realizó el test Chi-cuadrado dependiendo de la clasificación de DM1 del progenitor afecto. Se analizaron las variables: “sexo del progenitor afecto”, “gestación”, “aborto”, “sexo del hijo nacido” (tabla 8). Los resultados obtenidos no mostraron ninguna asociación significativa, lo que indicaría que los diferentes grados de gravedad de la enfermedad no serían relevantes, en un primer momento, para ninguna de ellas.

 

Estudio de regresión lineal. Se llevó a cabo un análisis de regresión lineal para estudiar la existencia de una relación entre el sexo del progenitor afecto y la probabilidad de terminar con éxito el programa de DGP, a través de las variables: “ovocitos mII”, “ovocitos mII x ciclo”, “nº embriones frescos”, “nº embriones analizados”, “nº embriones sanos”, “nº embriones afectos”, “tasa de embriones sanos”, “tasa de embriones afectos” y “tasa de fecundación”. El modelo obtenido tuvo un coeficiente de regresión lineal: R = 0,942 y un coeficiente de determinación:   r2 = 0,888. Estos resultados sugieren una correlación lineal que se podría explicar cómo que el 88,8 % de la variabilidad entre las variables predictoras puede ser atribuida a una relación lineal con el sexo del progenitor afecto. Se calculó, también, el test Anova para el modelo de regresión anterior, obteniéndose un nivel de significación estadística p = 0,100; de modo que, nuestros resultados, no mostraron diferencias significativas en la media en ambos sexos para cada una de las variables predictoras, probablemente debido al reducido tamaño muestral.

 

Estudio de correlación bivariada. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para las variables cuantitativas y el coeficiente de correlación Rho de Spearman para las variables continuas.

Estudio de correlación entre el sexo del progenitor afecto y la probabilidad de embarazo y de tener un hijo sano. Las variables analizadas fueron: “sexo del progenitor afecto”, “embriones mII x ciclo”, “nº embriones frescos”, “tasa de embriones sanos”, “tasa de fecundación” y “gestación” (tabla 9). Los resultados muestran una correlación positiva entre el número de ovocitos en mII por ciclo y el número de embriones frescos (coeficiente de correlación (R) = 0,555; p = 0,049), que puede ser explicada por el hecho de que cuanto mayor número de ovocitos en mII se obtengan, mayor será el número de embriones frescos que se puedan conseguir. No obstante, en ningún caso se pudo determinar una asociación entre ninguna de las variables estudiadas (valor de p > 0,05 para todos los casos) que pudiera sugerir cierta relación entre el sexo del progenitor afecto y la probabilidad de conseguir un embarazo.

Para la probabilidad de tener un hijo sano, se seleccionaron las variables: “sexo del progenitor afecto”, “nº embriones sanos” y “gestación” (tabla 10). Del mismo modo, no se pudo establecer ningún tipo de relación. De modo que, se descartarían diferencias en la probabilidad de poder tener descendencia sana dependiendo del sexo del progenitor afecto en la pareja.

Estudio de correlación entre el número de repeticiones CTG del progenitor afecto y la probabilidad de terminar la gestación con éxito. Las variables para el estudio fueron: “nº repeticiones CTG”, “gestación” y “parto” (tabla 11). Únicamente se pudo establecer una relación lógica y estadísticamente significativa entre gestación y parto, ya que si hay gestación la probabilidad de que haya parto es mayor (p = 0,000). Para el resto de variables no se ha podido determinar ninguna relación que indique que el número de repeticiones CTG del progenitor afecto sea indicativo para poder tener un hijo.

DISCUSIÓN

Acerca de la hipótesis de trabajo. Este estudio fue diseñado partiendo de los resultados de publicaciones anteriores en las cuales se pudo comprobar que el programa de DGP era una de las mejores aproximaciones reproductivas para aquellas parejas en las que uno de ellos es portador de DM1 (7, 8, 13). Con los resultados de este estudio se apoyaría la hipótesis anterior, señalando el DGP como la técnica más adecuada para poder tener descendencia libre de DM1. En este caso, de las 13 parejas que fueron incluidas en el estudio, se consiguieron 7 gestaciones de las cuales 2 abortaron y 5 llegaron a término dando lugar a recién nacidos libres de la expansión.

Influencia del sexo del progenitor afecto en la probabilidad de conseguir un embarazo. Se intentó encontrar si existía alguna relación entre el sexo del progenitor afecto y las variables que influyen, en última instancia, para conseguir una gestación. De las múltiples variables analizadas, solo se pudo determinar una relación significativa estadísticamente para la edad del hombre, siendo mayor cuando era su pareja la portadora de la enfermedad. Si tenemos en cuenta la relación inversa entre el resultado reproductivo y la edad (8, 9), esto puede ayudar a que se produzcan anomalías en los espermatozoides y que, como consecuencia, afecte a poder conseguir embriones aptos para la transferencia o que la gestación se pueda conseguir.

Han sido muchos los estudios publicados que analizan si la enfermedad altera la respuesta ovárica de la paciente, encontrándose tanto estudios a favor como en contra de dicha asociación (8, 14). Nuestros resultados no encontraron diferencias significativas en el número de ovocitos en mII total ni por ciclo entre ambos grupos, siendo la media levemente mayor en los casos de mujeres afectas. Por tanto, apoyarían la hipótesis de que la función gonadal permanece inalterada en mujeres afectas, sin que la enfermedad afecte a la correcta función del eje pituitario-ovárico (8).

Por otra parte, se estableció el mecanismo por el cual la DM1 lleva a un estado de resistencia insulínica (15-17). Si tenemos en cuenta que la hiperinsulinemia, resultante de la resistencia insulínica, es fundamental en el desarrollo del Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP), podría explicar el hecho de que las mujeres con DM1 tienen mayor prevalencia de SOP y, como consecuencia, presencia de oligo-amenorrea y mayor producción de ovocitos. Por otra parte, parece indicar que las mujeres afectas tienen pérdida de lívido, oligo-amenorrea y un aumento del riesgo de aborto espontáneo, aunque siguen sin ser probados (8). En nuestro caso, el número de abortos fue el mismo independientemente del sexo del progenitor afecto, por lo que, en un principio, no apoyarían esta idea. Además, la expansión en el número de repeticiones CTG provocaría una disminución de la expresión del gen Six5, localizado en el locus DM1 y adyacente a DMPK y que, en hombres, sería la consecuencia de una espermatogénesis deficiente y la disminución progresiva de la masa del testículo con la edad (18). Por el contrario, en el caso de mujeres afectas no se ha podido observar ningún efecto en la fertilidad (12, 19). Si tenemos en cuenta los resultados de este estudio, el REM mostró una media mayor en los casos donde la mujer fue la afecta en comparación con los casos donde lo fue el hombre, pero sin conseguirse una diferencia significativa que pueda apoyar los estudios anteriores.

A pesar de no conseguir una evidencia significativa, todos los resultados de los test realizados indicarían una tendencia de los datos que apoyarían que el sexo del progenitor afecto podría influir en el número de embriones sanos, siendo mayor en el caso en el que la afecta fuese la mujer. Esta tendencia también se ve, aunque menos evidente, para la tasa de embriones sanos. Este dato apoyaría la hipótesis de que las mujeres afectas de DM1 tienen mayor probabilidad de tener descendencia sana.

En cuanto al número y tasa de embriones afectos no hubo diferencias significativas entre ambos sexos, por lo que no se ha podido comprobar ni el fenómeno de anticipación más acusado en mujeres afectas con un número de repeticiones CTG superior a 79, ni la transmisión casi exclusiva por vía materna de las formas congénitas a los descendentes (20). Pese a esto, los últimos estudios explican que no solo el tamaño de la expansión CTG sería determinante para desarrollar la forma congénita o clásica, sino que el patrón de metilación alrededor del gen DMPK tendría un papel fundamental (21). En concreto, altos niveles de metilación adyacentes y aguas arriba de la repetición CTG presente en el gen DMPK, estarían representados en muestras de pacientes diagnosticados con DM1 congénita y no en casos de DM1 leve o clásica. Este patrón de alta metilación podría ser el causante de un fallo total en la supervivencia de los espermatozoides, ya que este estado epigenético sería la causa de la muy baja o ausente expresión del gen Six5, fundamental en la supervivencia espermatogénica (21, 22). Esta desventaja en la supervivencia celular de los espermatozoides que se traduciría en una elevada protección a los hombres de tener descendencia con DM1 congénita.

A pesar de obtener un resultado en el estudio de regresión lineal que sugirió una correlación entre el sexo del progenitor afecto y la probabilidad de embarazo, el resto de pruebas no mostraron dicha correlación en ninguno de los casos. Lo mismo ocurrió para la probabilidad de tener un hijo sano.

 

Influencia del número de repeticiones CTG del progenitor afecto en la probabilidad de conseguir un embarazado. Como se ha descrito anteriormente, el número de repeticiones CTG no tendría influencia sobre el resultado reproductivo. En mujeres afectas se ha podido observar que no existen diferencias entre el genotipo y la reserva ovárica. Esto podría ser explicado por dos fenómenos: presencia de mosaicismo somático y heterogeneidad en el tamaño de la expansión en diferentes tejidos de un mismo paciente (12, 19, 23). Por tanto, la ausencia de correlación podría explicarse por un mosaicismo de células somáticas y germinales (24, 25), con un número de repeticiones CTG diferente en el tejido ovárico y linfocitos, que enmascare el verdadero estado de la línea germinal del paciente (26).

Si tenemos en cuenta los resultados de nuestro análisis, se observó un exceso de embriones afectos para aquellos casos de DM1 clásica. Estos resultados ya se observaron en estudios anteriores (27-30), donde se habla de una proporción cercana a 2/3 de embriones afectos y 1/3 de embriones sanos, en contra de la esperable proporción 1/2 para ambos casos. De modo que, parece ser que sí existiría una transmisión preferencial de los alelos expandidos en DM1. Esta relación no fue estadísticamente significativa dependiendo del sexo del progenitor afecto. A pesar de ello, sí que se pudo destacar un aumento del número de embriones sanos para los casos leves que para los casos de DM1 clásica para ambos sexos. Por el contrario, el número de embriones afectos, dependiendo del sexo del progenitor afecto, varió en función del número de repeticiones CTG. En los casos donde el afecto fue el hombre, se pudo observar un aumento de embriones afectos para un número de repeticiones menores; mientras que, en los casos donde la mujer fue la afecta, parece ser que habría un mayor número de embriones afectos analizados cuando la expansión es grande. Por tanto, este estudio también apoyaría que, en hombres afectos, expansiones de 50-79 repeticiones CTG serían particularmente inestables y sujetas a grandes expansiones mientras que, expansiones mayores a 79 repeticiones CTG, a pesar de ser inestables, suelen contraerse. En oposición, en mujeres afectas, aquellas expansiones que superan las 79 repeticiones CTG son más propensas a expansiones mayores al transmitirse por vía materna (20, 31). Otra variable que puede apoyar este hecho es la tasa de fecundación, ya que la tendencia en la diferencia de medias en ambos grupos difirió en función del sexo del progenitor afecto, siendo mayor la tasa de fecundación en casos de DM1 clásica cuando el hombre fue el afecto y, por el contrario, para los casos de DM1 leve cuando la afecta fue la mujer. Además, con los resultados de este proyecto, no se podría conocer si este hecho influye de manera determinante en el resultado reproductivo, ya que a pesar del menor número de embriones sanos a transferir, 4 de las 5 gestaciones conseguidas fueron de progenitores afectos de DM1 clásica y, únicamente, en un caso se produjo aborto.

CONCLUSIONES

Agradecimientos. Me gustaría agradecer, en primer lugar, a mi tutora Ana Monzó, por su completa disposición para ayudarme y aconsejarme a lo largo del Trabajo Final de Máster. A Ramiro Quiroga, por facilitarme información y enseñarme, junto a mi tutora, cómo funciona la consulta de Diagnóstico Genético Preimplantacional. Al igual que Juan Vicente y Edurne, por haberme acompañado en el laboratorio, tanto en FIV como en Genética, enseñándome todos los pasos del programa y solucionar las dudas que me han surgido a lo largo de la realización del proyecto de manera desinteresada.