Aspectos a considerar en la criopreservación de tejido ovárico

INTRODUCCIÓN

La criopreservación de corteza ovárica se presenta como una de las alternativas para la preservación de la fertilidad (1-4). En la última década, se ha pasado de los ensayos experimentales con animales a los primeros embarazos en mujeres sometidas a trasplante de corteza ovárica (5-10).

Si bien se trata de un notable éxito médico, no es menos cierto que todavía quedan cuestiones por resolver a la hora de unificar criterios para asegurar la mayor eficiencia y seguridad en la aplicación de este avance científico. Las respuestas hay que obtenerlas en un entorno multidisciplinar que aglutina diferentes especialidades, entre las que cabe destacar: Ginecología, Oncología, Reproducción Asistida, Trasplante y Criobiología.

En este trabajo se abordan temas relativos al autotrasplante de corteza ovárica desde la perspectiva del banco de tejidos.

MARCO REGULADOR

Como se recoge en el documento informativo editado desde la Organización Nacional de Trasplantes (11), hay que tener presente que se trata de un tejido con una doble componente fisiológica: endocrina y reproductora. De acuerdo con esta idea, como elemento con función hormonal, la regulación aplicable es la recogida en el Real Decreto 1301/2006 (12); por otro lado, al contener gametos, debe acogerse a lo dispuesto en la Ley 14/2006 (13). De hecho, esta ley, se refiere en su artículo 11 a la crioconservación de tejido ovárico como fuente de gametos.

OBTENCIÓN

Por razones obvias, conviene realizar el procedimiento de extracción antes de iniciar el tratamiento potencialmente gonadotóxico. Es imprescindible contar con el correspondiente consentimiento informado, autorizando: el procedimiento de extracción, la gestión de datos sensibles, la toma de muestras para estudios adicionales y, finalmente, la aceptación o denegación para que el tejido pueda ser destinado a otros fines (por ejemplo, investigación) si no fuera factible el trasplante.

No obstante, puesto que la conservación de corteza ovárica puede ser considerada en pacientes menores de edad, conviene hacer algunas puntualizaciones. El ordenamiento jurídico español reconoce la plena titularidad de los derechos de los menores de edad y su capacidad evolutiva para ejercerlos según su grado de madurez; de tal modo que los menores pueden ir ejerciendo paulatinamente esos derechos a partir aproximadamente de los 12 años (14). De acuerdo con ello, deberían ser consultados y dar su aprobación, siempre que se les considere suficientemente maduros para entender y asimilar adecuadamente la información proporcionada. En caso contrario, de acuerdo con lo dispuesto en el artículo 7 del Real Decreto 1301/2006 (12), será responsabilidad del representante legal del menor otorgar el consentimiento.

Al tratarse de un recurso para la preservación de la fertilidad en mujeres, la edad de las pacientes que pueden beneficiarse del mismo es un factor limitante. En general, el límite superior se suele situar en torno a los 35-37 años (6,9,15).

En cuanto al tamaño de los fragmentos, el espesor debe ser lo suficientemente fino para asegurar la correcta difusión de la solución crioprotectora, garantizando la presencia de estructuras foliculares, especialmente los tipos más inmaduros. De acuerdo con ello, se recomienda un grosor entre 1 y 2 mm. La superficie, en principio, no es un parámetro limitante. En general, se utilizan fragmentos que van desde 1x2 mm hasta 5x10 mm. Poirot y col (15) han calculado la densidad esperada de folículos primordiales y primarios en función de la edad, resultando: 350-400/mm3, antes de los 10 años; 70-80/mm3, entre 10 y 15 años; 30-35/mm3, entre 15 y 34 años. De acuerdo con estos datos, se puede estimar el tamaño de los fragmentos a procesar para contener una cantidad suficiente de folículos primordiales y primarios (los autores citados sugieren al menos 1000). Lógicamente, se trata de un dato orientativo, ya que la reserva ovárica está sujeta a variaciones entre personas que, con una misma edad cronológica, evidencian diferencias en su edad biológica (16). Además, hay que tener presente que tras la criopreservación y descongelación se produce una pérdida de folículos funcionales. Por esta razón, es conveniente conocer el rendimiento del protocolo utilizado en cada banco, mediante el correspondiente proceso de validación, ya que las cifras ofrecidas por diferentes laboratorios varían significativamente (entre el 25% y el 90% de lesión folicular).

SEGURIDAD

El riesgo potencial de enfermedad residual en el tejido extraído y la posibilidad de reintroducirla en la paciente con el trasplante es uno de los aspectos sobre los que más se está debatiendo en los últimos años (1-3,17-24). La seguridad del implante en cáncer de mama ha sido publicada por nuestro grupo y posteriormente confirmada por otros (20-22). En la enfermedad de Hodgkin, el implante también se considera seguro (23). Por el contrario, en leucemias ha sido demostrada la infiltración por células malignas del tejido ovárico (24).

Las modernas tecnologías de diagnóstico por imagen representan el primer nivel a la hora de considerar la indicación del procedimiento de extracción. Seguidamente, la valoración macroscópica del tejido por parte del ginecólogo durante el procedimiento quirúrgico de extracción, ofrece una oportunidad para recabar más datos de interés para incorporar en el algoritmo de decisión. Además, el imprescindible estudio histológico de una muestra del material a conservar proporciona información de especial relevancia. No obstante, los resultados pueden estar condicionados por las técnicas de detección utilizadas. Así, algunos trabajos han evidenciado la necesidad de aplicar pruebas diagnósticas (técnicas de inmunohistoquímica y biología molecular) que garanticen la máxima seguridad para descartar este riesgo (17,19). A este respecto, considerando que el período de almacenamiento de las muestras de corteza ovárica va a ser de varios años, hasta que se considere a la paciente curada de la enfermedad que indicó el tratamiento; además de las pruebas de detección que se consideren oportunas en el momento de la extracción, conviene disponer de muestras adicionales por si en el futuro pudieran aplicarse sobre ellas nuevas técnicas, más sensibles o/y específicas.

La maduración folicular «in vitro» es una tecnología actualmente en fase de desarrollo que puede tener una notable trascendencia a la hora de obtener células reproductoras de pacientes con elevado riesgo de enfermedad residual en la corteza ovárica (25). En estos casos, la utilización de técnicas de reproducción asistida puede aportar seguridad. En mujeres con mutación en el gen BRCA1 /BRCA2 el riesgo de desarrollar un cáncer de ovario a lo largo de su vida es muy superior al de la población general, en estas pacientes el abordaje de la preservación de la fertilidad debe hacerse de forma más multidisciplinar e individualizada, si cabe..

TRANSPORTE

Se estima que la corteza ovárica puede tolerar un periodo de isquemia fría entre 3 y 5 horas (9,26,27). Además, Kim y col (26) han observado que la presencia de sustancias antioxidantes en la solución de transporte puede limitar la aparición de fenómenos de apoptosis y que la temperatura durante esta fase no es un parámetro significativo. Por el contrario, Soleimani y col (28) sí han encontrado diferencias en función de la temperatura, destacando la importancia de mantener el tejido en torno a 4ºC, en medio nutritivo preferentemente con albúmina. En sus conclusiones, estos últimos recomiendan no superar las 6 horas de isquemia fría, aunque también sugieren la posibilidad de procesar tejido conservado en las condiciones propuestas hasta un día después de la extracción (lógicamente, asumiendo una pérdida folicular). Van der Ven y col (29) coinciden con esta idea, utilizando como solución de transporte una formulación habitualmente empleada para la conservación de órganos..

CRIOPRESERVACIÓN

En la actualidad, la congelación es el método de almacenamiento más utilizado para la conservación de células y tejidos humanos. Los folículos primordiales toleran bien la criopreservación, a diferencia de los ovocitos, más grandes, con el núcleo en metafase 2 de la meiosis, siendo además el huso muy sensible al calor y estrés osmótico (30). Los primeros, son más pequeños, con menor actividad metabólica, carentes de zona pelúcida y gránulos corticales periféricos. No obstante, hay que tener en cuenta que se trata de estructuras con cierta complejidad, ya que incorporan diferentes tipos celulares, resultando esencial que los mecanismos de cooperación metabólica entre ellos permanezcan inalterados. Se han descrito diferencias ultraestructurales entre folículos primordiales frescos y tras congelación (31,32).

Se han propuesto diferentes modalidades para la congelación de la corteza ovárica. Las variaciones vienen determinadas principalmente por la velocidad de enfriamiento que se va a utilizar. En función de este parámetro, se puede distinguir:



Lenta: 0,3ºC/min. Se consigue con la utilización de congeladores programables que garantizan un control sobre el proceso (figura 1).



Normal: entre 1 y 2ºC/min. Utilizada para la congelación de un amplio número de tipos celulares y tisulares. Además de los aparatos citados en el punto anterior, se puede utilizar dispositivos «pasivos» para el enfriamiento (figura 2), que se colocan en el interior de un congelador convencional a -80ºC.

Rápida: entre 100 y 200ºC/min. Se alcanza cuando se sumerge directamente en nitrógeno líquido un criotubo conteniendo la corteza ovárica embebida en solución crioprotectora. La congelación del tejido en ausencia de líquido no modifica significativamente la velocidad de enfriamiento (figura 3).

Ultra-rápida: entre 1600 y 2000ºC/min. Permite la vitrificación y se puede lograr por introducción directa del tejido en nitrógeno líquido, después de incubarlo en presencia de la solución crioprotectora. En nuestro laboratorio hemos comprobado que también se puede conseguir estas tasas de enfriamiento con el tejido incluido en una bolsa (tipo Cryocyte® o Hemofreeze®, por ejemplo) (figura 3).



El protocolo más utilizado es el de congelación lenta aunque, en los últimos años, la vitrificación se está mostrando como una opción a considerar, ya que minimiza el tiempo de congelación y podría favorecer la preservación de diferentes tipos celulares. No obstante, exponer el tejido directamente al nitrógeno líquido (como se propone en los trabajos dirigidos en esta línea) representa un cierto riesgo de contaminación. La esterilización del nitrógeno no resulta sencilla, por lo que se sugiere utilizar un pequeño volumen de nitrógeno estéril para vitrificar y luego se transfiere la pieza vitrificada (con la ayuda de unas pinzas pre-enfriadas) a un criotubo para su almacenamiento. En general, para la vitrificación se utilizan dos procedimientos:



Goteo: incluyendo pequeños fragmentos de tejido embebidos en la solución crioprotectora en una pipeta Pasteur y depositando gotas sobre el nitrógeno líquido, con lo que se generan esferas conteniendo el tejido (33,34).

Con soporte: empleando materiales (láminas metálicas, por ejemplo) para sujetar los fragmentos de tejido durante la exposición al nitrógeno líquido (33,35,36). Resulta especialmente curioso el método utilizado por Wang y col (37), ensartando los fragmentos de tejido en una aguja de acupuntura a modo de «pinchito», lo que ofrece la posibilidad de procesar varios fragmentos simultáneamente.



Nuestra experiencia con el uso de bolsas, ofrece resultados similares en cuanto a la tasa de enfriamiento (figura 3) aportada en los trabajos anteriormente citados. No obstante, estas bolsas son caras y, actualmente, los tamaños disponibles exceden notablemente las dimensiones que la corteza ovárica requiere, por lo que hay que adecuar el tamaño del recipiente, desechando la mayor parte del mismo. Por otro lado, los sellados térmicos en las de tipo Hemofreeze® (Fresenius Kabi AG) hay que realizarlos con un dispositivo especial, también costoso; a diferencia de las Cryocyte® (Baxter), que pueden sellarse con aparatos convencionales. También es importante en el caso del uso de bolsas asegurar que no queda aire en torno al tejido (lo que interferiría la velocidad de congelación), que queda cubierto por una mínima película de la solución crioprotectora. Respecto al empleo de criotubos para el almacenamiento en nitrógeno líquido, tienen como principal ventaja la facilidad para su archivo; no obstante, hay que asegurarse de utilizar tapones tipo «macho» (con rosca interna en el tubo y junta de silicona) con el fin de asegurar la estanqueidad. Para el almacenamiento en un medio líquido también es aconsejable el empleo de un doble embalaje protector.

Respecto a la congelación lenta, el uso de congeladores programables requiere un notable desembolso económico; además, como resulta obvio, al reducir la velocidad de enfriamiento, se alarga considerablemente el proceso, exigiendo durante ese tiempo una dedicación de personal y material a dicha tarea.

Isachenko y col (38) han obtenido significativamente mejores resultados con la congelación lenta que con la vitrificación (goteo) y la congelación rápida. No obstante, en este trabajo, los autores han estimado una velocidad de enfriamiento aproximada de 220ºC/min, lejos de la considerada necesaria para una vitrificación eficiente. Además, la velocidad de calentamiento durante la descongelación fue de unos 150ºC/min, que tampoco resulta adecuada para evitar la recristalización. Por el contrario, Li y col (34), han obtenido resultados satisfactorios con la vitrificación por goteo en comparación con la congelación lenta.

Otro aspecto de relevancia es la composición de la solución criopreservadora. En cuanto a la elección del crioprotector, cuya principal misión es minimizar el riesgo de lesión por la generación de cristales de hielo y el estrés osmótico (39), el dimetilsulfóxido (DMSO) es uno de los más utilizados. Una concentración del 10% es suficiente para abordar con garantías los procedimientos de congelación lenta y normal. También se utilizan como sustancias crioprotectoras el glicerol, el 1,2-propanodiol y el etilenglicol, entre otros. Empleando una velocidad ultra-rápida, para aproximar la temperatura crítica de enfriamiento (evitando la formación de hielo) a la tasa de descenso térmico que podemos conseguir, es necesario un incremento en la concentración de sustancias crioprotectoras. No obstante, esto hay que conseguirlo evitando el potencial efecto tóxico derivado de la mayor concentración del crioprotector y proporcionando una tasa crítica de calentamiento durante la fase de descongelación que descarte la aparición de fenómenos de recristalización.

En general, la presencia de suero humano en la solución que se va a emplear para congelar el tejido se asocia con un efecto positivo, especialmente para las pacientes de mayor edad (40); sin embargo, la adición de disacáridos podría ser perjudicial (41). Diversos autores han encontrado en la combinación de DMSO y etilenglicol una adecuada relación para la vitrificación, empleando cada uno de ellos en una proporción del 15-20% (33,35). La exposición a la acción de los crioprotectores se verifica de forma secuencial, con una primera incubación en una solución con la mitad de la concentración final, seguida por otro periodo ya en presencia de la solución definitiva. Es importante asegurar que su duración es suficiente para garantizar la actuación de dichas sustancias, hasta alcanzar el equilibrio. Si se reduce la temperatura para minimizar potencial el efecto tóxico, será necesario ampliar el tiempo de incubación, ya que se ralentiza la capacidad de penetración.

La congelación de la corteza ovárica a 2ºC/min también ofrece resultados satisfactorios (42). Incluso, utilizando dispositivos pasivos de enfriamiento, Martínez-Madrid y col (43) han conseguido alentadores resultados con la criopreservación de ovarios enteros.

DESCONGELACIÓN

El método utilizado para la congelación va a determinar el tipo de descongelación a emplear. Tomando como punto de partida la temperatura de almacenamiento en la fase líquida del nitrógeno (-196ºC), si el tejido se ha congelado con la modalidad lenta o la normal, se requiere una primera etapa de calentamiento lento (a temperatura ambiente durante un minuto aproximadamente) seguida por la inmersión en un baño a 37ºC (44). En el caso de la vitrificación, el aumento de temperatura debe ser igualmente ultra-rápido, sumergiendo el tejido en el baño inmediatamente.

Una vez descongelado el tejido, hay que retirar la solución crioprotectora. Con este fin, el método más utilizado es la dilución progresiva con concentraciones decrecientes de sacarosa e, incluso, del propio crioprotector (44). Finalmente, el tejido se embebe en un medio de cultivo que bien puede ser el mismo que se emplea durante el transporte al banco tras la disección.

TRASPLANTE

A la hora de proceder a la utilización clínica del material almacenado, se puede efectuar el trasplante ortotópico (en su posición anatómica) o heterotópico (en otra localización, generalmente intramuscular o subcutánea). Una vez trasplantado el tejido, el tiempo necesario para la revascularización es un periodo crítico durante el cual se produce una significativa pérdida folicular, que puede llegar al 90% (45). Para evitar esto, la creación de un tejido de granulación para favorecer la angiogénesis y neovascularización se presenta como una estrategia eficaz (3).

La localización heterotópica presenta el inconveniente de que las anormales variaciones de temperatura y presión a que se ve sometido el tejido pueden comprometer el desarrollo folicular (3). De hecho, se han observado diferencias de tamaño en el ovocito maduro entre ambos tipos de trasplante (46). En general, los datos aportados por la experiencia acumulada sugieren que el trasplante ortotópico resulta más aconsejable, pudiendo facilitar la posibilidad de fecundación natural (9-10).

El desarrollo de metodologías para la criopreservación de ovarios intactos, con su pedículo vascular (43), resolvería en buena medida los problemas derivados de la isquemia post-trasplante, mediante una anastomosis vascular.