Correlación entre los parámetros seminales, fragmentación de ADN espermático y estrés oxidativo en pacientes atendidos en un centro de fertilidad en el norte del Perú
Objetive: To determine the correlation between microscopic seminal parameters, sperm DNA integrity and oxidative stress (dependent superoxide anion) Material and methods: Prospective study conducted at the Laboratory of Andrology “In Vitro Gestar” (Chiclayo – Perú), from October 2013 to August 2015. 171 patients were evaluated. Two cutoffs were evaluated (18% y 30%) for the DNA fragmentation index (IFA) in normozoospermic (NORMO) and altered parameters (ALTERADO). The level of oxidation was evaluated in semen sample (N1: No detectable, N2: Lower Level, N3: Middle Level) and Middle Level (N3) was correlated in patients NORMO and ALTERADO. The media were calculated using the Mann – Whitney Test and for the study of correlation was used the Spearman Test, used the software SPSS 22.0 for Windows. Results: It was determined that 45,03% of men attended presented some alteration in seminal parameters. We determined that the seminal parameter most affected was the progressive motility. We determined a correlation positive between IFA and age negative (r=0,198; P= 0,009) and correlation negative between IFA and sperm concentration (r=-0,155; P=0.043), total concentration (r=-0,170; P=0,027), progressive motility (r=-0,336; P=0.000) and vitality (r=-0,289; P=0.000). In the cutoff of 18%, were found significant difference in the media between the two groups (Group 1: IFA≤18% y Group 2: IFA>18%) in the age (36,74±6,05 VS 39,60±7,94), progressive motility (47,33±16,82 VS 38,27±19,80) and vitality (80,52±2,16 VS 75,79±13,71), respectively. Also, in the cutoff of 30% were found significant difference in the media between the two groups (Group 1: IFA≤30% y Group 2: IFA>30%) in the progressive motility (46,24±17,65 VS 29,91±16,89), normal morphology (5,11±2,34 VS 3,67±2,19) and vitality (80,43±8,76 VS 67,33±17,73), respectively. Futhermore, we determined that the media of IFA the patients with asthenozoospermia and oligoasthenoteratozoospermia were significantly higher with respect a normozoospermic. We found the patients with N3, the seminal parameters as sperm concentration (123,22±83,70 VS 58,33±58,49), total concentration (261,54±158,84 VS 156,87±183,43), progressive motility (55,46±12,08 VS 31,06±15,73), normal morphology (7,00±2,91 VS 4,07±2,48), vitality (85,75±6,41 VS 75,36±9,43) and IFA (14,74±7,08 VS 23,01±15,22) presented significant differences in NORMO and ALTERADO patients, respectively. Conclusions: The results show that patients with some alteration in the seminal parameter present significantly different with respect a patients with normoozospermia in the IFA and N3. It is proposed these test are used as routine and complementary in the seminal analysis to provide better diagnosis of male infertility.
Láyonal Germán Acosta Campos 1,2, Carlos Antonio Rivas Miñano 1,2, Lissett Karen Chiscul Requejo 1,2, Jheny Díaz Orrego 1,2 1IN VITRO GESTAR, Centro de Fertilidad y Reproducción Asistida, Chiclayo – Perú. 2BIOGENETIC LAB SAC, Laboratorio de Investigación en Genética y Reproducción, Chiclayo – Perú.
Palabras clave
Keywords
INTRODUCCIÓN
Se estima que aproximadamente la frecuencia de parejas infértiles a nivel mundial se encuentra entre 10 – 15 % (1). Se ha determinado que aproximadamente el 50 % de los casos de infertilidad se encuentran asociados a un factor masculino (2). Un estudio en Perú determino que el 47,5 % de los varones atendidos en un centro de fertilidad presentaban alguna alteración microscópica en los parámetros seminales (3). Estas cifras determinan la importancia de la evaluación del semen en el diagnóstico de la fertilidad.
El espermatograma es el examen de diagnóstico básico más importante en el estudio de la infertilidad masculina. En general para cada parámetro analizado en el espermatograma se establecen valores límites inferior de referencias publicados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (4). Sin embargo se estima que aproximadamente del 10 – 15 % de los varones infértiles presentan un espermatograma normal (5), además se ha determinado que los parámetros del espermatograma no aportan una información suficiente para interpretar el grado de fertilidad o la posibilidad de embarazo de una pareja (6-7). Por ello es indispensable establecer otras pruebas de diagnóstico que se utilicen de rutina y complementarias al espermatograma, como la determinación del índice de fragmentación del ADN espermático para medir la integridad del ADN (8-12) y el test de estrés oxidativo (13).
Actualmente se ha determinado la fragmentación de ADN espermático como un factor importante en la etiología de la infertilidad masculina (14, 15). Con respecto al origen del daño en el ADN del espermatozoide, nos enfrentamos a una naturaleza multifactorial como 1) apoptosis durante el proceso de espermatogénesis en el epitelio de los túbulos seminíferos, 2) por las roturas en las cadenas del ADN producidas durante la remodelación de la cromatina espermática en la espermiogénesis, 3) por las especies reactivas de oxígeno (ERO) durante el transporte del espermatozoide de los túbulos seminíferos al epidídimo, 4) por la inducción de las caspasas endógenas y endonucleasas, 5) por daño inducido en la quimioterapia, radioterapia y tóxicos ambientales (16).
Estudios han determinado que el estudio de fragmentación del ADN espermático es un fenómeno dinámico, ya que tras la eyaculación la fragmentación tiende aumentar con el tiempo (17, 18), fenómeno que afecta a todas las especies de mamíferos y que tiene una correlación con el tipo y la calidad de la protaminación (19, 20).
Entre los test más importantes para evaluar el nivel de fragmentación del ADN del espermatozoide en el semen humano, el test de Dispersión de la Cromatina (SCD) se destaca por su fácil y rápida aplicación, se basa en la descondensación diferencial de la cromatina en aquellos espermatozoides que presentan su ADN fragmentado respecto aquellos que lo mantienen intacto (8, 21). Diferentes estudios utilizando el test de SCD han determinado la capacidad reproductiva del espermatozoide y su correlación con los parámetros seminales y la calidad embrionaria tras FIV o ICSI (8, 9, 22, 23).
El estrés oxidativo celular es una consecuencia de un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y los mecanismos de defensa antioxidantes que posee la célula. Las ERO incluye los radicales de oxigeno tales como el radical hidroxilo (OH-), anión superóxido (O2-) y peróxido de hidrógeno (H2O2) y también los reactivos de especies nitrogenadas (24). A pesar de su inherente vulnerabilidad al ataque oxidativo, los espermatozoides también generan ERO. Los espermatozoides necesitan de bajas cantidades de ERO para que la capacitación, hiperactivación y la reacción acrosómica tenga lugar (25). Concentraciones elevadas de ERO se han encontrado en pacientes infértiles (26), y puede afectar los parámetros seminales y causar daño en los componentes celulares, particularmente en lípidos, proteínas y ADN (27). El principal tipo de ERO producido es O2-, el cual produce espontáneamente H2O2. (28).
Se han establecido varios ensayos para la evaluación de los diferentes niveles de ERO y moléculas responsables para producir estrés oxidativo, pero ninguno de ellos se utiliza frecuentemente en los laboratorios de andrología por su complejidad y costos. El test OxiSperm, es un test nuevo, barato y simple que ayuda a determinar una posible concentración elevada de anión superóxido (O2-) presentes en el eyaculado. El test está basado en el ensayo de nitro azul de tetrazolio (NAT) en la forma de un gel reactivo (GR). El test NAT está basado en la capacidad de la sal de tetrazolio en agua soluble convertirse por acción del anión superóxido (O2-) en cristales azules en agua insoluble, denominado formazan (29). Según las concentraciones de anión superóxido (estrés oxidativo) en la muestra seminal, el formazan producirá un color característico en el GR.
El objetivo de este estudio es determinar la correlación entre los parámetros seminales, fragmentación de ADN (Test SCD) y estrés oxidativo (Test oxiSperm).
MATERIAL Y MÉTODOS
Pacientes
Se evaluaron a 171 pacientes con sospecha de infertilidad que asistieron al Laboratorio de Andrología del Centro de Fertilidad y Reproducción Asistida “In Vitro Gestar”, Chiclayo – Perú, durante los meses de Octubre 2013 y Agosto 2015. Se excluyeron a los pacientes que presentan: azoospermia, atrofia testicular, criptorquidia, tratamientos con antibióticos o antioxidantes, diabetes, historia de quimioterapia y radioterapia, enfermedades crónicas, así mismo los pacientes no presentaban ni gripe ni fiebre al menos en las dos últimas semanas a la obtención de muestra. Este estudio siguió las recomendaciones y fue aprobado por el comité de bioética de BIOGENETIC LAB SAC.
Obtención de la muestra seminal y Espermatograma
Las muestras fueron obtenidas por masturbación luego de una abstinencia sexual de 3 a 7 días en contenedores de plástico estériles. Una vez obtenida las muestras, estas fueron rotuladas y colocadas en la incubadora (Galaxy CO2 48S) a 37°C por 30 – 60 minutos para que ocurra la licuefacción completa y proceder a su análisis. Los parámetros macroscópicos y microscópicos fueron analizados siguiendo las recomendaciones de la OMS. En la evaluación microscópica la concentración espermática fue determinada utilizando la cámara de Neubauer®, la movilidad espermática utilizando la cámara de Makler® (Sefi-Medical Instruments, Haifa – Israel), para la evaluación de la morfología espermática (Coloración Papanicolaou) se siguieron los criterios estrictos de Kruger, la vitalidad mediante la tinción de eosina Y. Para la determinación de las concentración de las células redondas se contaron las células no espermáticas de las láminas preparadas para la evaluación de la morfología espermática, tal como lo recomienda la OMS. Los valores límites de inferiores de referencia que hemos seguido para clasificar los pacientes con muestra seminal normozoospérmica (NORMO) y con alguna alteración en los parámetros seminales (ALTERADO) son los establecidos por la OMS (4) como concentración (≥ 15 millones espermatozoides/ml), movilidad progresiva (≥ 32,0 %), morfología espermática (≤ 4,0% de espermatozoides normales) y vitalidad espermática (≥ 58,0 % de vivos).
Fragmentación de ADN espermático. Test de la Dispersión de la Cromatina (SCD)
Para determinar el Índice de Fragmentación de ADN (IFA) espermático se utilizó el test Halosperm (SCD, Dispersión de la cromatina del espermatozoide – Halotech DNA SL, Madrid, España) (21) con modificaciones menores (8). La muestra seminal fue diluida en PBS hasta alcanzar una concentración de 5 a 10 millones de espermatozoides/ml. El eppendorf con agarosa (bajo punto de fusión) fue incubado por 5 minutos a 90 a 100°C, luego fue colocado en baño maría a 37° por 5minutos, posterior se adiciono 20µl del semen diluido y se homogenizó. Se colocaron 10µl del homogenizado del eppendorf sobre una lámina portaobjeto pre tratada con agarosa (normal punto de fusión) y fue cubierta con lámina cubreobjeto de 22x22 mm. Las láminas portaobjeto fueron colocadas en refrigeración a 4°C por 7 minutos, luego se retiro el cubreobjeto con cuidado y se le adicionó la solución ácida (80µl HCL en 10ml de agua destilada) por 7 minutos. Luego se retira la solución ácida y se colocó la solución lisis por 25 minutos. Se elimino la solución lisis y la lámina portaobjeto fue colocado en agua destilada y etanol de 70, 90 y 100 por dos minutos cada uno. Se deja secar a temperatura ambiente y finalmente es teñida con el colorante Wright. Se analizaron 500 espermatozoides por cada lámina para determinar el IFA. Se distinguió 5 tipos de halos: halo grande, halo mediano, halo pequeño, sin halo y degradado, se considera el halo grande y mediano como espermatozoides con fragmentación normal y el halo pequeño, sin halo y degradado como espermatozoides fragmentados (Figura 1). Se evaluó dos puntos de corte:
A= 18 %; Grupo 1 (IFA ≤ 18 %) y Grupo 2 (IFA > 18 %) (8, 9).
B= 30 % Grupo 1 (IFA ≤ 30%) y Grupo 2 (IFA > 30 %) (8, 14, 22, 31, 32)
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Estrés Oxidativo. Test OxiSperm
Para determinar el nivel de estrés oxidativo se utilizo el test oxiSperm (Halotech DNA SL, Madrid, España). Mediante este test podemos evaluar un posible exceso de anión superóxido (O2-) en las muestras seminales. El test utiliza el GR con capacidad de virar su color original al reaccionar con el anión superóxido, responsable del estrés oxidativo que puede estar presente en el semen humano. De acuerdo a la concentración del anión superóxido, se forma un precipitado de color variable desde ligeramente rosado hasta morado o casi negro, esto se puede clasificar y determinar fácilmente observando la escala de color (Figura 2).
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El eppendorf que contiene el GR (25µl) es calentado hasta 90°C, luego es colocado en baño maría a 37°C por 5 minutos. Se le adiciona 25µl de la muestra de semen y se homogeniza. Se gelifica el homogenizado a 4°C por 5 minutos, luego se incuba por 45 minutos en la incubadora a 37°C y se observa la intensidad de color, la intensidad de color se relaciona con la concentración de anión superóxido presente en la muestra: N1=No detectable, N2=Nivel bajo, N3=Nivel Medio y N4=Nivel Alto. Se considera N1 y N2 como oxidación normal y a N3 y N4 como oxidación aumentada.
Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados mediante el software SPSS 22.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). Los diferentes grupos fueron calculados por los test no paramétricos Mann – Whitney. Las correlaciones entre el IFA y los parámetros seminales se determino mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Se considero estadísticamente significativo cuando P<0.05.
RESULTADOS
La edad de los pacientes atendidos oscila entre los 20 y 65 años con una media de 37,63±6,80. Se encontró que el 45,03% de los varones atendidos en el centro de fertilidad presentaban una alteración microscópica de alguno de los parámetros del espermatograma El 28,07 % de la población total presentó el parámetro de la movilidad progresiva por debajo del límite inferior (≤32,0 %), considerándose la anomalía más frecuente en los varones con sospecha de infertilidad en Chiclayo.
La media de la edad, parámetros seminales e IFA entre los pacientes con muestra seminal normozoospérmica (NORMO) y con alteraciones en algún parámetro seminal (ALTERADO) son resumidos en la tabla 1. No se encontraron diferencias significativas en la edad, volumen seminal, espermatozoides con residuos citoplasmático ni células redondas entre los dos grupos. Se encontró diferencias significativas en la concentración espermática, concentración total, movilidad progresiva, morfología normal, vitalidad e IFA entre los dos grupos.
Se encontró diferencias significativas en la edad, movilidad progresiva y vitalidad entre los grupos del IFA 18 % (Tabla 2). Así mismo se encontró diferencias significativa en la movilidad progresiva, morfología normal y vitalidad entre los grupos del IFA 30 % (Tabla 2).
El análisis de la correlación de Spearman indicó que en la población total que la edad (r=0,198; P=0,009) presenta una correlación positiva con el IFA, mientras que la concentración espermática (r=-0,155; P=0,043), concentración total (r=-0,170; P=0,027), movilidad progresiva (r=-0,336; P=0,000) y vitalidad (r=-0,289; P=0,000) presentan una correlación negativa significativa con IFA (Figura 3).
La media de los pacientes que presentaron astenozoospérmia (24,42 ± 15,67) y oligoastenoteratozoospermia (27,28 ± 22,00) fueron significativamente mayor a los pacientes normozoospérmicos (14,08 ± 7,08). Así mismo se determinó que el 21,3% de pacientes normozoospérmicos presentaban un IFA>18% (Tabla 3).
Al evaluar la oxidación no obtuvimos oxidación alta (N4), por lo que no lo incluimos en el análisis estadístico. Se encontró que el 25,5 % de los pacientes normozoospérmicos normozoospérmicos(NORMO) presentaban una oxidación elevada y que el 63,7 % de los pacientes con alguna alteración espermática (ALTERADO) presentaban oxidación normal (Tabla 4). Así mismo no se encontró diferencias significativas entre las medias del IFA en los tres tipos de niveles de oxidación (Tabla 4).
En los pacientes con oxidación elevada (N3) se determinó que existe diferencias significativas en los parámetros seminales y el IFA entre las muestras NORMO y ALTERADO (Tabla 5). No se encontró diferencias significativas en la edad, volumen seminal, en los espermatozoides con residuos citoplasmático ni en la concentración de células redondas (Tabla 5).
DISCUSIÓN
Actualmente se conoce que un estudio básico del semen (Concentración, movilidad, morfología, vitalidad) no es suficiente para determinar un diagnóstico de fertilidad masculina. Se conoce que para tener un correcto desarrollo embrionario depende en parte de la calidad del ADN espermático (determinación del IFA) (10, 30), así mismo se sabe que una de las principales causas del daño del ADN espermático es el estrés oxidativo (16, 27).
Nuestros estudio determinó que el 45,03 % de los varones atendidos en la ciudad de Chiclayo presentaban algún parámetro seminal afectado, siendo la movilidad progresiva como el parámetro más afectado. Estos resultados se encuentran en concordancia con los estudios realizados en la ciudad de Lima por un centro de fertilidad (3).
Para la determinación del IFA se agregó el punto de corte del 18 % al estudiado por muchos autores de 30 % (8, 14, 22, 31, 32) ya que estudios han determinado que mediante el test SCD, valores por encima del 18 % tiene correlación significativa sobre la predicción de la fertilización del ovocito tras FIV o ICSI (9), además de presentar una correlación significativa con los parámetros seminales (8). Los resultados presentados confirman que los varones que tienen algún parámetro seminal afectado presentan un IFA significativamente mayor con respecto a los normozoospérmicos (Tabla 1), tal como lo demostró Acosta y Dueñas (8) y Fernández et al., (21) utilizando el mismo test.
Se determinó que los pacientes con IFA mayores a 18 % presentan los valores de volumen seminal, movilidad progresiva y vitalidad, reducida significativamente con respecto al IFA menor o igual que 18 % (Tabla 2), así mismo en la población total se encontró una correlación negativa entre el volumen seminal, movilidad progresiva y vitalidad con respecto al IFA. Nuestro estudio difiere a los resultados encontrados por Acosta y Dueñas (8) que también encontraron diferencias significativas en la concentración y morfología. Por otro lado Yilmaz et al., solo encontró diferencias significativas en la concentración espermática (32). La discordancia entre estos estudios se puede deber a diferencias endocrinas, étnicas, localización geográfica, ambiental, nutricional, tipo de vida y genético, aún incluso entre dos ciudades del mismo país.
Se observó que el 21,3 % y 2,1 % de la población normozoospérmica presentaba índice de fragmentación alta utilizando los puntos de corte de 18 % y 30 % (Tabla 3), respectivamente. Los resultados con el punto de corte de 18 % concuerdan con los obtenidos por Saleh et al. y Frattini et al. utilizando las técnicas de Tunel y SCSA, respectivamente (33, 34). Se ha determinado que el daño en el ADN espermático se correlaciona con la diminución de la fertilidad luego del coito o con técnicas de reproducción asistida teniendo como resultado una disminución en la tasa de embarazo (33, 35-38). Por lo tanto el análisis del daño en el ADN del esperma puede identificarnos pacientes infértiles idiopáticos con parámetros seminales normales (33).
Se observó que los pacientes con diagnóstico de astenozoospermia y oligoastenoteratozoospermia presentaban valores de IFA significativamente mayores a los pacientes normozoospérmicos (Tabla 3). Estos resultados concuerdan por los estudios realizados por Fernández et al., presentando valores similares (21). Se conoce que altas concentraciones de estrés oxidativo tiene efectos negativos en la concentración, movilidad y morfología (39) y el estrés oxidativo es la causa más importante de daño a nivel de ADN espermático (16,27).
El aumento de daño a nivel de ADN espermático se puede dar por múltiples causas: siendo el estrés oxidativo la causa principal, por una condensación anormal de cromatina durante la espermiogénesis, por un proceso apoptótico y reducción de antioxidantes en el semen (16, 40).
Se ha determinado que el estrés oxidativo es una de las mayores causas de infertilidad masculina, estando presente en niveles aumentados en el plasma seminal en un 30 % a 40 % de estos pacientes (41). En nuestro estudio se observo que el que el 30,4 % de los pacientes presentaban oxidación elevada (N3) (Tabla 4). Dentro de este grupo encontramos pacientes normozoospérmicos (NORMO = 46,2 %) y con algún parámetro afectado (ALTERADO= 53,8 %). Nuestros resultados concuerdan con otros estudios donde se encuentra la presencia de sustancias oxidantes en el semen (42, 43), la diferencia se encuentra en la técnica utilizada ya que el kit OxiSperm mide una aproximación directa de la cantidad de anión superóxido en la muestra mientras que los otros estudios hacen un medida a través de la transformación enzimática con equipos especiales.
No se observó diferencias significativas en las medias del IFA en comparación con los niveles de oxidación (Tabla 4). Nuestros resultados concuerdan con los obtenidos por Gongora et al. utilizando los mismos test en sus análisis (44). Nosotros sospechamos que la oxidación elevada de nuestros pacientes puede provenir vía próstata y no del epidídimo y así mismo que estas muestras pueden presentar una velocidad aumentada de fragmentación una vez eyaculado. A todos nuestros pacientes se les evaluó la fragmentación del ADN una vez ocurrida la licuefacción.
Se observó en la Tabla 5 que en todos los niveles de oxidación, los pacientes ALTERADO presentan valores disminuidos significativamente con respecto a los NORMO. Así mismo ocurre con el IFA. Por otro lado se observó que ni las células redondas ni los espermatozoides con residuos citoplasmáticos presentaban diferencias significativas, llevándonos a pensar que no son la fuente de la oxidación elevada. Las razones que expliquen la existencia de pacientes normozoospérmicos y con oxidación elevada aún son desconocidas (45), nosotros sospechamos que dicha oxidación elevada puede provenir vía próstata y no del epidídimo. Así mismo podemos sospechar que estos pacientes normozoospérmicos y con oxidación N3 pueden presentar una velocidad aumentada de fragmentación de ADN y de calidad espermática con respecto a los normozoospérmicos con N1 y N2. La velocidad aumentada de fragmentación de ADN nos lleva a pensar que en un tiempo corto los espermatozoides presentaran un IFA elevado siendo esto correlacionado negativamente con la calidad embrionaria y la tasa de éxito tras FIV o ICSI (9).
Con respecto a los parámetros seminales y el IFA en pacientes con N3, se determinó que los pacientes ALTERADO presentaban una media aumentada significativamente de IFA con respecto a los pacientes NORMO (Tabla 4), tal como lo determinó Kao et al., al encontrar que espermatozoides con movilidad lenta y estrés oxidativo elevado presentaban un IFA aumentado (46). Se ha determinado que cuando los pacientes presentan muestras seminales con concentración, movilidad, morfología y vitalidad disminuida se puede dar por las alteraciones de la membrana del espermatozoide causando este proceso un aumento de la concentración de malondialdehido (producto de la peroxidación lipídica causa por el estrés oxidativo) (47). El malondialdehido se ha correlacionado positivamente con el daño del ADN espermático (26).
Actualmente muchos de los médicos no realizan pruebas a los varones infértiles con espermatogramas normales, como por ejemplo un test de fragmentación y un test de oxidación debido a sus costos elevados y la dificultad de los laboratorios de realizarlo como pruebas de rutina. El análisis convencional del recomendado por la OMS (4) no aborda algunos aspectos de la calidad y función del semen y su poder discriminativo es muy baja y es por ello que se observa un gran número de varones con infertilidad idiopática (48, 49). Así mismo no es posible poder determinar un tratamiento óptimo. Nosotros reconocemos que nuestro estudio es relativamente pequeño y debe ser replicado por otros.
En conclusión nuestros resultados han determinado que el daño del ADN espermático y estrés oxidativo están claramente implicados en la patogénesis de la infertilidad masculina. Y que el estudio de espermatograma como prueba única no es suficiente para determinar el grado de fertilidad de los pacientes. El test OxiSperm ha demostrado ser un estudio sencillo, rápido y económico para la determinación de los niveles de estrés oxidativo. Nosotros proponemos que el test de fragmentación de ADN espermático (Halosperm, SCD) y el test de oxidación (oxiSperm) se deberían realizar como pruebas de rutina complementarias al espermatograma en todos los laboratorios de Andrología.
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Edición Nº 37.JULIO-DICIEMBRE 2020
