Cultivo folicular in Vitro

La criopreservación de ovocitos y de embriones tras fecundación in Vitro (FIV) previa al tratamiento antineoplásico constituyen los métodos que habitualmente se utilizan en los tratamientos de preservación de la fertilidad en mujeres adultas. Otra de las opciones es la congelación de tejido ovárico, utilizada sobretodo en niñas y mujeres jóvenes. Hay que tener en cuenta que la criopreservación y cultivo del ovario entero se hace inviable debido a su gran tamaño. El trasplante de fragmentos de tejido ovárico es una buena opción para la preservación de la fertilidad a pesar de haberse realizado en un número reducido de casos (1). Esta técnica se está optimizando en numerosos grupos clínicos. Se ha demostrado que el trasplante de tejido ovárico puede restaurar la fertilidad (2, 3) aunque existe un cierto riesgo de reintroducir células malignas tras el trasplante, sobretodo en determinados tipos de cáncer (mama, leucemia, neuroblastoma). Por este motivo, se están desarrollando distintos protocolos para el cultivo in Vitro de folículos inmaduros y permitir así la obtención de ovocitos aptos para ser fecundados, lograr un correcto desarrollo embrionario que dé lugar a embriones con capacidad de implantación tras la transferencia.

En otras áreas de investigación, podría también ser útil lograr el crecimiento y maduración folicular in Vitro en estudios sobre la acción de fármacos en el ovario o en el cultivo de ovocitos para generar bancos de gametos de animales en peligro de extinción.

Se han llevado a cabo un gran número de estudios sobre maduración in Vitro de folículos en distintos modelos animales. En 1996, Eppig & O´Brien lograron el crecimiento de folículos primordiales en cultivo y, tras fecundación in Vitro y transferencia embrionaria, lograron el nacimiento de un ratón sano (4). El modelo del ratón ha servido para estudiar algunos principios básicos de crecimiento y formación del folículo, el proceso de imprinting y también ha permitido la identificación de factores de crecimiento y diferenciación (5). Muruvi y col. en 2009 consiguieron que folículos primarios de oveja aislados y cultivados in Vitro alcanzasen estadios de folículo secundario (6). Recientemente, Mc Laughlin y col. (2010) han logrado obtener ovocitos de >100µm de diámetro tras 15 días de cultivo a partir de folículos primordiales en bovinos (7). En cerdo, Wu y col. lograron el crecimiento de folículos preantrales hasta estadio antral tras cultivo in Vitro (8).

En la especie humana, combinando el cultivo de fragmentos de corteza ovárica con el cultivo de folículos aislados se ha logrado el crecimiento de folículos primordiales y primarios hasta estadios secundarios y antrales (9,10). La limitada disponibilidad de tejido ovárico para investigación hace que los avances en cultivo folicular in Vitro sean lentos. Además, la complejidad per se del desarrollo folicular in vivo, dificulta el diseño de un sistema de cultivo in Vitro que permita el crecimiento completo de los ovocitos de los folículos primordiales o primarios. Todavía falta dilucidar muchos factores que intervienen en el inicio del crecimiento folicular, las condiciones de cultivo, el turnover metabólico y el ambiente fisiológico que permite el desarrollo correcto del folículo.

El objetivo de este trabajo es revisar el conocimiento actual acerca de los métodos de aislamiento y cultivo folicular in Vitro y evaluar sus aplicaciones en técnicas de reproducción asistida.

FOLICULOGÉNESIS IN VIVO

En la especie humana, las células germinales primordiales aparecen en el feto femenino aproximadamente a las 3 semanas de haberse producido la fecundación y migran desde el epitelio de la vesícula vitelina hacia la cresta genital. Una vez allí, las células germinales primordiales reciben el nombre de ovogonias. Durante el proceso de migración, la actividad mitótica de estas células es muy elevada (11).

Cerca del tercer mes de gestación se concentran las células somáticas mesenquimales alrededor de las ovogonias formándose los folículos primordiales. Entre la semana 12-13 de gestación, las ovogonias inician la meiosis quedando bloqueadas en la profase I de la primera división meiótica (estadio de diplotene). En torno a las 20 semanas de gestación, la dotación inicial de folículos primordiales alcanza su número máximo (7x106 ) el cual se reduce drásticamente al nacer, siendo de aproximadamente de 1-2x106 (12). En el momento del nacimiento los ovocitos se encuentran bloqueados en estadio de diplotene de la primera división meiótica. Los cromosomas están descondensados y empaquetados en el núcleo al cual se le denomina vesícula germinal (VG).

Desde el nacimiento hasta la menopausia y de forma continua, se desarrollan grupos de folículos primordiales. Estos folículos están destinados a la atresia hasta que no reciben el estímulo gonadotrófico suficiente. A partir de la pubertad, los pulsos de hormona folículoestimulante (FSH) permiten que estos grupos de folículos primordiales se activen iniciando la fase de crecimiento, reiniciándose la meiosis en el folículo que se desarrolla en cada ciclo menstrual.

Se conoce por foliculogénesis el proceso mediante el cual los folículos primordiales crecen y se diferencian hasta folículo preovulatorio o folículo de Graaf. En las primeras etapas de este proceso, los folículos primordiales se activan cuando las células somáticas que rodean al ovocito se hacen cuboidales e incrementan su actividad proliferativa, formando una capa de células de la granulosa. A partir de este momento al folículo primordial se le denomina folículo primario.

Cuando el folículo primario alcanza un diámetro de 200-250µm y las capas de células de la granulosa son numerosas, se denomina folículo secundario13. Las células del estroma ovárico circundantes a la membrana basal se diferencian y son denominadas células de la teca interna, mientras que las más alejadas reciben el nombre de teca externa. Entre las células de la granulosa y el ovocito existen uniones intercelulares tipo gap que facilitarán la comunicación bidireccional y permitirán el paso de nutrientes, precursores metabólicos y factores de crecimiento. El ovocito en el interior del folículo aumenta de tamaño y secreta las glicoproteinas que constituirán la zona pelúcida. Las células de la granulosa proliferan y empiezan a expresar receptores para la FSH y las células de la teca continúan su diferenciación, expresando receptores para la hormona luteinizante (LH). Estos fenómenos junto con la acumulación de líquido folicular en los espacios intercelulares de las células de la granulosa convierten al folículo secundario en folículo antral.

Durante la fase folicular del ciclo menstrual numerosos folículos antrales van aumentando de tamaño hasta que uno de ellos crece por encima de los demás (fenómeno de selección y dominancia) entrando los otros en atresia. Este folículo dominante liberará un ovocito en estadio de metafase II tras el pico endógeno de LH.

El folículo preovulatorio o folículo de Graaf alcanza un tamaño de 20-25mm en el momento de la ovulación y se caracteriza por la existencia de una única cavidad rellena de líquido folicular o antro. El ovocito en su interior está rodeado por células de la granulosa especializadas, llamadas células del cúmulo que son funcionalmente distintas de las células de la granulosa que tapizan el antro (células murales).

Se estima que en la especie humana el tiempo que tarda un folículo primario en llegar a estadio secundario es de aproximadamente 120 días, el folículo secundario tarda 60-80 días en crecer hasta folículo antral y éste tarda 14 días en denominarse folículo preovulatorio o folículo de Graaf (14). (Figura 1)

Regulación del crecimiento folicular y maduración ovocitaria.

Existen diversos factores autocrinos, paracrinos y endocrinos que regulan el crecimiento y desarrollo folicular así como la maduración ovocitaria. Entre los factores que influyen en la transición de folículos primordiales a primarios se encuentra la proteína kit ligand (KL) y el factor de crecimiento derivado de fibroblastos (FGF) el cual estimula la mitosis y promueve la diferenciación de las células de la granulosa (15). La insulina también participa promoviendo la esteroidogénesis en las células de la granulosa y de la teca.

La hormona antimülleriana (HAM) producida por las células de la granulosa tiene un efecto inhibitorio en el reclutamiento inicial de folículos primarios a partir del pool de folículos primordiales (16). En la transición de folículos primarios a secundarios el ovocito juega un papel importante ya que produce factores implicados en el crecimiento folicular y la maduración ovocitaria como el FGF, el factor de crecimiento y diferenciación 9 (GDF 9) y la bone morphogenetic protein 15 (BMP 15), que estimulan la proliferación de las células de la granulosa (17). El KL favorece el crecimiento del ovocito y su maduración citoplasmática mientras que las activinas secretadas por las células de la granulosa promueven la proliferación celular y la esteroidogénesis (18). Los esteroides condicionan la concentración de receptores de hormona folículo estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH). A partir del estadio de folículo preantral, el crecimiento folicular es dependiente de la acción de las gonadotropinas circulantes. La FSH recluta folículos precursores que comienzan su desarrollo preovulatorio, aunque finalmente sólo uno de ellos logre completar el crecimiento e inicie la maduración preovulatoria (fenómeno de selección y dominancia). Además, la FSH estimula la división de las células de la granulosa y la formación de líquido en los antros foliculares. También promueve la secreción de inhibina folicular por parte de las células de la granulosa que junto con los estrógenos producen el fenómeno de feed back negativo sobre la secreción de FSH por la hipófisis. El folículo que mejor responda a la FSH será el folículo dominante que crecerá y secretará estrógenos, mientras que los demás entrarán en atresia. La LH tiene un papel fundamental en el proceso del crecimiento folicular, dominancia y maduración ovocitaria. Esta hormona actúa sobre las células de la teca activando la síntesis de andrógenos que, por acción de la aromatasa, se convierten en estrógenos en las células de la granulosa.

Sin embargo, niveles demasiado elevados de LH pueden tener un efecto inhibidor del crecimiento folicular (12). En el folículo antral también existen factores intrafoliculares locales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de la insulina (IGF), el factor de de crecimiento transformante (TGF), el FGF-2, y la interelukina –β los cuales inhiben los mecanismos de apoptosis. El vascular endothelial growth factor (VEGF) es un promotor de la angiogénesis, lo que maximiza la influencia de las gonadotropinas sobre este folículo (19). El pico preovulatorio de LH desencadena la maduración nuclear y citoplasmática del ovocito in vivo: tiene lugar la germinal vesicle breakdown (GVBD) completándose así la primera división meiótica para progresar a estadio de metafase II y se recluta mRNA para la síntesis de determinadas proteínas que serán necesarias para sostener las futuras divisiones mitóticas del embrión. La LH también promueve la expansión del cúmulo oóforo, y sus células secretan ácido hialurónico que formará una matriz mucosa necesaria para la extrusión del ovocito del folículo en el momento de la ovocitación.

Cultivo folicular in Vitro

En mujeres tratadas con quimio y radioterapia de las que se dispone de tejido ovárico criopreservado y no se desea realizar trasplante de dicho tejido, el cultivo folicular in Vitro constituye una alternativa a tener en cuenta. En los años noventa se empezaron a desarrollar técnicas de cultivo folicular in Vitro en humanos. El objetivo de esta técnica es obtener folículos antrales a partir de los folículos primordiales y primarios presentes en la corteza ovárica en condiciones de laboratorio. Existen dos métodos distintos, el primero de los cuales consiste en el trasplante de una suspensión de folículos aislados previamente madurados in Vitro mientras que el segundo método consistiría en el cultivo in Vitro de folículos aislados hasta la obtención de ovocitos en metafase II.

Aislamiento folicular

Una vez los folículos primordiales han iniciado su crecimiento, éstos pueden aislarse y continuar el cultivo como folículos individuales, rodeados por la lámina basal y algunas células del estroma ovárico. Lograr aislar folículos sin alterar su viabilidad es de vital importancia para realizar un correcto cultivo in Vitro. El aislamiento de folículos puede realizarse mecánicamente (tijeras, bisturí, aguja) o enzimáticamente. La ventaja del sistema mecánico es que la membrana basal del folículo permanece intacta y que las células de la teca permanecen adheridas a éste, ambos indispensables para el correcto desarrollo del folículo in Vitro. Sin embargo, este método es laborioso y presenta un bajo rendimiento en tejidos fibrosos como el tejido ovárico humano.

La digestión enzimática disgrega la matriz extracelular de manera que los folículos pueden ser aislados más fácilmente con la ayuda de agujas. Un inconveniente importante de este método es que si el tiempo de exposición enzimática es muy prolongado, se separan las células de la teca del folículo y puede deteriorarse la membrana basal. Al separarse las células de la teca, los cultivos se convierten entonces en cultivos de complejos ovocito-células de la granulosa en lugar de cultivos de folículos íntegros. El daño en la membrana basal puede provocar una migración espontánea de las células de la granulosa del ovocito y esto afecta directamente al crecimiento y desarrollo del ovocito al perder la estructura tridimensional.

Demeestere y col. en 2002 compararon el efecto del aislamiento mecánico y enzimático sobre folículos de ratón, que cultivaron durante 12 días (20). Aunque el método enzimático proporcionó folículos con mayor número de células de la teca que produjeron mayor concentración de estradiol, los dos métodos de aislamiento folicular proporcionaron unas tasas de maduración ovocitaria similares.

En 2004, Martínez-Madrid y col. describieron la posibilidad de recuperar folículos humanos aislados mecánica y enzimáticamente utilizando un gradiente discontinuo de Ficoll21. En su estudio, cortaron fragmentos de tejido ovárico con un diseccionador de tejidos y los incubaron con colagenasa. La mezcla resultante se centrifugó con gradientes de Ficoll. El 99.9% de los folículos recuperados se situaban en las interfases de los gradientes. El análisis por tinción fluorescente mostró que el 95.8% de los folículos recuperados eran viables.

Dolmans y col. en 2006 desarrollaron un método de aislamiento enzimático que consistía en incubar fragmentos de tejido ovárico humano con liberasa en lugar de utilizar colagenasa (22). La incubación con liberasa permitió aislar menor cantidad de folículos que la colagenasa pero éstos presentaban mejor morfología, viabilidad y ultraestructura.

Métodos de cultivo folicular

Distintos autores han publicado metodologías para el cultivo de folículos in Vitro. La metodología descrita por Hovatta y col.(23) en 1997 describía la utilización de soportes porosos (millicell inserts, Millipore) cubiertos con matriz extracelular sintética (Matrigel, Millipore) para cultivar fragmentos de tejido ovárico. El medio de cultivo empleado (MEM con glutamato, HSA, FSH, una mezcla de insulina/transferrina y selenio y antibióticos/antimicóticos). Una incubación durante 7-21 días permitió un incremento significativo de crecimiento folicular hasta estadios secundarios. Este mismo grupo describió que el cocultivo con AMPc o GDF-9 promovía una mayor tasa de crecimiento de folículos hasta estadios secundarios obteniendo una mayor proporción de folículos viables (24, 25). También se observó en otro estudio que la presencia de HAM inhibía el crecimiento folicular en los estadios más tempranos (26).

Telfer y col.(9) en 2008 diseñaron un método de cultivo folicular en dos pasos: primero cultivaron fragmentos de tejido ovárico humano en placas multipocillo con medio de cultivo tamponado y suplementado (McCoy´s medium, BSA, glutamina, antibióticos, transferrina, selenio, insulina y ácido ascórbico). Cultivaron durante 6 días y tras observar crecimiento folicular, aislaron los folículos mecánicamente. Una vez aislados, seleccionaron los folículos con un diámetro de aproximadamente 100µm (±3.4) con ovocito visible, membrana basal intacta y sin cavidad antral y los cultivaron 4 días. En los días 2 y 4 de cultivo midieron el diámetro de los folículos observando crecimiento acelerado hasta estadio antral. Este es el primer estudio en la especie humana que demuestra que folículos primordiales pueden crecer hasta estadios antrales en un cultivo in Vitro de 10 días de duración.

Hay que tener en cuenta que en condiciones in vivo, los folículos están integrados en la matriz extracelular (ECM), que consiste en un complejo tridimensional de fibras y huecos que facilita la comunicación entre el folículo y el entorno ovárico. Para simular este fenómeno, debería disponerse de matrices extracelulares sintéticas tridimensionales o scaffolds que soportasen el crecimiento facilitando la comunicación intercelular y permitiendo la organización y la diferenciación de los folículos. West y col. en 2007 evaluaron la eficacia de diferentes hidrogeles para el cultivo folicular (27). En su estudio vieron que materiales como el colágeno y el Matrigel permitían la expansión del folículo en crecimiento pero las enzimas necesarias para su degradación dañaban el folículo. Por otra parte, el alginato, polímero natural producido por una alga parda, demostró poseer propiedades óptimas para ser utilizado como scaffold en el cultivo folicular in Vitro (28).

Resultados similares fueron obtenidos por Amorim y col. en 2009 al cultivar folículos preantrales humanos aislados en una matriz de alginato. El 90% de los 159 folículos cultivados sobrevivieron al cultivo y se observó crecimiento en todos ellos (29).

Un aspecto importante a tener en cuenta en los cultivos foliculares in Vitro es el posible efecto de éstos sobre el imprinting en los ovocitos. La información epigenética se adquiere durante la gametogénesis, de ahí la enorme relevancia de los cultivos que sostienen la foliculogénesis y la maduración in Vitro de ovocitos para evitar desórdenes de imprinting de origen materno (30). Poirot y col. en 2003 analizaron en el modelo de ratón el efecto del cultivo in Vitro sobre el imprinting. Analizaron la metilación del ADN en distintos genes en ovocitos en estadio de vesícula germinal obtenidos a partir de cultivo in Vitro de folículos preantrales. Al comparar el patrón de metilación de estos ovocitos con ovocitos control, detectaron ganancia y/o pérdida de grupos metilo en los distintos genes analizados, demostrando que el cultivo in Vitro afectaba la reprogramación nuclear (31).

Una reciente publicación de Anckaert y col. sostiene que un cultivo prolongado de ovocitos de ratón no supone ninguna modificación en el patrón de impronta genómica (32). En su estudio examinaron el patrón de metilación de ciertos genes de ovocitos metafase II obtenidos tras el cultivo de folículos preantrales y maduración in Vitro y mostraron patrones de metilación del ADN similares a los controles. Es imprescindible asegurar condiciones de cultivo in Vitro que no comprometan el correcto desarrollo del ovocito en cuanto a fenómenos de impronta genética para plantear su posible utilización clínica.

Los métodos de cultivo folicular in Vitro han permitido el crecimiento de folículos primordiales y primarios hasta estadios antrales, aunque el ritmo de crecimiento es superior al que se produce in vivo.

CONCLUSIONES

Aunque el cultivo folicular in Vitro presenta muchos beneficios potenciales, existen todavía muchos aspectos a clarificar. La maduración de folículos in Vitro a partir de fragmentos de tejido ovárico debe permitir la obtención de ovocitos aptos para ser fecundados y que los embriones resultantes se desarrollen correctamente. La complejidad de dicho proceso in vivo requiere seguir investigando para optimizar la metodología in Vitro antes de plantear su posible aplicación terapéutica.