La causa principal de aborto espontaneo recurrente idiopático  es aneuploidía embrionaria

La pérdida de embarazo recurrente (RPL), definido como dos o más abortos espontáneos (1), causa desánimo incalculable tanto entre pacientes como médicos. La RPL afecta a entre el 2-5% de las parejas (2) y puede deberse a muchos factores, como anomalías genéticas, anatómicas, endocrinas e inmunológicas (1, 3). No obstante, >50% de las parejas que padecen RPL muestran causas desconocidas o idiopáticas (4).

Una causa posible de la RPL idiopática es que la pareja produce más embriones aneuploides de lo normal y que sean éstos los que provocan los abortos espontáneos. Marquard et al. encontró que el análisis cromosómico podría explicar el 80% de los casos de RPL idiopática en mujeres > 35 años (5) y muchos otros autores han observado una tasa más elevada de aneuploidía en pacientes con RPL (4, 6-14). Por lo tanto, la hipótesis de trabajo que justifica el uso del diagnóstico genético preimplantacional (DGP) para la indicación de RPL es que este análisis identificaría los embriones euploides a ser seleccionados para transferencia, lo cual reduciría la tasa de aborto espontáneo en parejas con RPL. De hecho, todos los estudios que han utilizado  DGP para esta indicación y que han evaluado la tasa de pérdida del embarazo han observado un descenso en la tasa de aborto espontáneo (15-18).

Estudios tempranos, no obstante, se basaron en la evaluación de embriones en estadío de división con hibridización fluorescente in situ (FISH por sus siglas en ingles, Fluorescence in situ Hybridization) y típicamente sólo evaluaron 7-12 cromosomas. En un meta-análisis (19), se analizaron cuatro estudios observacionales (18, 20-22) donde  se hizo la biopsia de 1-2 células de embriones en estadío de división el día 3 en pacientes fértiles con RPL comparando los resultados con los de pacientes con RPL que habían concebido de manera natural. En los cuatro estudios se realizó evaluación con FISH (analizando 3-9 cromosomas). La tasa de aborto espontáneo (TAE) varió entre el 0-10% (media 9%) en pacientes con RPL sometidas a DGP, comparado con el 14-52% (media 28%) en el grupo con concepción natural (P=0,0013).

Con frecuencia es difícil encontrar un grupo de control idóneo en estudios de RPL. Hay que decidir si comparar la pareja con RPL con otras parejas, fértiles e infértiles,  sometidas a DGP o únicamente con parejas con un historial de RPL (21). Para obviar este problema, Garrisi et al. (17) y Munné et al. (18) compararon la tasa de pérdida de embarazo con la tasa esperada según Brigham et al. (23) y encontraron que el DGP con FISH reducía las tasas de aborto espontáneo de forma significativa, desde la tasa esperada del 36% al 13% (14). Pacientes a las que se les ofrecieron DGP pero que lo rechazaron presentaron una tasa de aborto espontáneo del 44%. Estos datos también ofrecen una manera de comparar pacientes con RPL que utilizan DGP con controles adecuados. El efecto beneficioso de DGP en la indicación de la RPL se observó en pacientes con RPL tanto fértiles como infértiles en tratamiento con la FIV (17). Sin embargo, estos estudios utilizaron la FISH, evaluaron un número limitado de cromosomas y se basaron en biopsias de embriones del día 3, una práctica que datos recientes indican podía tener un efecto negativo sobre el potencial de implantación del embrión tras la biopsia, mientras que la biopsia en estadío de blastocito no parece tener este efecto deletéreo (24).

Datos recientes demuestran que la aCGH proporciona un análisis más exacto, basado en los 24 cromosomas completos que permite detectar aneuploidías que de otra manera permanecerían sin identificar (24-27). Además, es posible que con la biopsia del blastocito, que permite evaluar más de una célula, se reduce la probabilidad de diagnóstico equivocado. Esto es posible porque en este estadío se pueden analizar mayor número de células y porque parece que el mosaicismo es menos prevalente en blastocitos que en embriones en estadío de división. Cuando el mosaicismo está presente en blastocitos, parece que se distribuye tanto en la masa de células interiores como en trofoectodermo (25, 26). El cultivo de blastocitos es una práctica que se está haciendo más extensa y, cuando se utiliza conjuntamente con DGP, produce tasas de embarazo más elevadas (27-30).

Si la tecnología precoz del DGP basado en la FISH ya demostraba una reducción significativa de abortos espontáneos en pacientes con RPL, es posible que avances actuales como la biopsia de blastocitos combinada con la aCGH posibiliten reducciones mayores en el riesgo de aborto espontáneo a la vez que aumentos en las tasas de embarazos, para hacer posibles transferencias de un único embrión. El objetivo del trabajo actual ha sido determinar posibles efectos beneficiosos del DGP con la aCGH en pacientes con RPL comparado con las pérdidas de embarazo esperadas en pacientes con RPL y con una población de controles infértiles.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes

Se incluyeron en el estudio pacientes con cariotipo normal, sin anomalías uterinas ni trastornos endocrinos y con un historial de dos o más abortos espontáneos idiopáticos a partir de ≤ 20 semanas de gestación. Se excluyó a toda portadora de translocaciones. Las pacientes incluyeron 287 ciclos en parejas tanto fértiles como infértiles. Las parejas recibían tratamientos con tecnologías de la reproducción asistida (TRAs) en distintos centros (predominantemente en NYU Fertility Center, Nueva York, EEUU; ART Reproductive Center, Beverly Hills, California, EEUU; Fertility Centers of Illinois, Highland Park, Illinois, EEUU; Lifequest Center for Reproductive Medicine, Toronto, Ontario, Canadá y Main Line Fertility and Reproductive Medicine, Bryn Mawr, Pennsylvania, EEUU). El DGP se realizó con biopsia de embriones del día 3 (n=193) o del día 5 (n=94) seguido de análisis con aCGH en Reprogenetics, Livingston, Nueva Jersey. Todas las biopsias del día 3 fueron transferidas el día 5.

Adicionalmente, la tasa observada de aborto espontáneo después del DGP en cada sujeto se comparó con la tasa esperada calculada a raíz del historial de cada uno según 1) los parámetros de predicción identificados en el estudio de Brigham et al. (edad, número de pérdida previas) (23) y utilizados en estudios similares anteriores de RPL (17, 18); y 2) con la tasa esperada de aborto espontáneo en una población infértil que se utilizó como control tal y como se informó en los EEUU a la Society of Assisted Reproduction Technology (SART) (Sociedad de Tecnología de la Reproducción Asistida) en función de la edad materna y el centro clínico (excluyendo a cinco pacientes de Lifequest Centre for Reproductive Medicine, Toronto, Ontario).

Las variables en los grupos del estudio se compararon con análisis chi cuadrado y la prueba t exacta de Fisher según el caso. Los resultados específicos medidos incluyeron la tasas de euploidía, implantación (TI), embarazos clínicos y embarazos en curso terminados en parto vivo. El porcentaje de embriones euploides se calculó utilizando el número de embriones euploides dividido por el número total de embriones a los que se realizó biopsia. La TI se calculó como el número de sacos gestacionales intrauterinos visualizados con ecografía por número total de embriones transferidos. El embarazo clínico se definió como la presencia de saco(s) gestacional(es) intrauterino(s) con actividad cardiaca fetal documentada por ecografía. Un embarazo en curso se definió como uno que había superado el segundo trimestre y un aborto espontáneo se consideró como una pérdida después de < 20 semanas.

Procedimiento DGP

Se utilizaron diferentes métodos de biopsia de embriones el día 3, según el centro de fertilidad. En general, todos los centros utilizaron o bien ácido o bien láser para romper la zona pelúcida con técnicas previamente descritas (31, 32). Para la biopsia de blastocitos, todos los centros hicieron eclosionar el embrión el día 3 o 5 de desarrollo y aislaron un trozo de trofoectodermo extruido el día 5 que cortaron con láser (varios modelos y fabricantes). Las células objeto de biopsia se colocaron en tubos Eppendorf, se congelaron en hielo seco y se transportaron el mismo día o durante esa misma noche a Reprogenetics para el DGP. Este análisis se realizó con el método descrito por Gutierrez-Mateo et al. sin modificaciones (25). Con la biopsia de trofoectodermo, se hizo el muestreo de varias células, mientras que con biopsias en estadío de división sólo es posible analizar una, o al máximo dos células (33).

Todas las pacientes dieron su consentimiento informado por escrito según el protocolo del comité de ética correspondiente (Institutional Review Board [IRB]). Se determinó que, tratándose de un análisis retrospectivo con datos des-identificados, este estudio no necesitaba aprobación del IRB.

RESULTADOS

Se analizaron un total de 2.282 embriones (1.710 con biopsia el día 3, 572 en estadío de blastocito) de 44 centros y 287 ciclos. La edad materna media en el momento de la biopsia era de 36,7 año ± 4,2 (rango 21-45) en pacientes con una media de 3,3 ± 1,2 (rango 2-7) pérdidas anteriores. La comparación entre las biopsias a 3 días y las a día 5 reveló que no existían diferencias estadísticas en cuanto a la edad materna ni el número de pérdidas previas. Además, la comparación entre sujetos < 35 y ≥ 35 años de edad indicó que tampoco había diferencias en cuanto al número de pérdidas anteriores ni el día de la biopsia.

Resultados de aneuploidía

De los 2.282 embriones, el 35,2% (n=803) resultaron ser euploides, el 60,8% (n=1.388) aneuploides y el 4,0% (n=9) no analizables (tabla 1). Se realizó la biopsia de una media de 8,9 ± 4,7 (rango 1-35) embriones encontrando que 2,8 ± 2,9 (rango 0-21) eran normales. Una proporción significativamente mayor de embriones euploides se encontraron con las biopsias del día 5 comparado con las del día 3 (47,0% vs. 31,2%; P <0,0001; ratio de riesgo 1,51, intervalo de confianza [95% IC] del 95% d 1,35-1,68; tabla 1). Cabe señalar que en 52 de los ciclos (18,1%) no se encontraron embriones euploides para su transferencia. De estos ciclos, 34 se realizaron después de biopsia el día 3. La probabilidad de no tener embriones aneuploides aumentaba con la edad, desde el 5% (4/80) en mujeres < 35 años hasta el 23% (48/207) en mujeres ≥ 35 años de edad (P <0,001).

Transferencias y resultados de embarazos

De los 287 ciclos de biopsias, 181 resultaron en transferencias (en una paciente se realizaron dos transferencias de una cohorte de biopsia). En 52 ciclos no se encontraron embriones normales para transferencia, en 4 ciclos no se había realizado la transferencia en el momento de recopilar los datos del estudio y en 51 ciclos (17%) los datos sobre la transferencia y el resultado del embarazo no estuvieron disponibles. Reprogenetics no tiene acceso al registro de embarazos de los centros que utilizan sus servicios, sino que sólo recopila la información de aquellos que les mandan la información. Los datos de los ciclos que se perdieron en el seguimiento correspondían a pacientes significativamente menores (35,4 ± 4,5; P = 0,002), quienes tuvieron más embriones a los que se hizo biopsia (9,7 vs. 7,6; P = 0,004) y más embriones normales (3,9 vs. 2,6; P = 0,003) que en la muestra total, aunque no hubo diferencia en el número de pérdidas anteriores. No obstante, los ciclos perdidos en el seguimiento se incluyeron en este estudio para calcular la tasas arriba mencionadas de aneuploidía.

Los ciclos para los que se obtuvo información para el seguimiento eran similares a los de la muestra total. La edad media en el momento de la biopsia era de 36,9 ± 4,1 años y las pacientes tenían un historial de 3,3 ± 1,2 pérdidas anteriores. En los 181 ciclos de transferencias, se hizo la transferencia de una media de 1,65 ± 0,65 (rango 1-4) embriones. La tasa global de embarazos en los que se produjo implantación era del 56,4% (n=102). La tasa global de implantaciones era del 45,5% (136/299) por embrión transferido. Se encontró ritmo cardiaco fetal en 133 de los 136 sacos detectados para una tasa global de embarazos clínicos del 55,2% (100/181 transferencias). En el momento de redactar este trabajo, la tasa combinada de embarazos en curso y partos vivos era del 92,1% (94/102).

Se realizó la transferencia el día 5 de un número significativamente mayor de embriones con biopsia del día 3 (media 1,76 ± 0,64) que con biopsia en estadío de blastocito (media 1,47± 0,61; P = 0,004). No se observaron diferencias significativas en el número medio de sacos gestacionales o actividad cardiaca fetal entre los dos grupos. Se produjeron tasas mayores de embarazos con implantación (65% [43/66] vs. 51% [59/115]) con biopsia el día 3 (P = 0,04) y de embarazos clínicos en el grupo con biopsia en estadío de blastocito (tabla 2). No se detectó diferencia significativa entre la tasa de embarazos con implantación por transferencia, implantación o embarazos clínicos entre los 5 grupos de edades según la clasificación de la SART ( < 35, 35-37, 38-40, 41-42 y >  42 años). Tampoco se detectó diferencia significativa cuando se compararon pacientes < 35 con las ≥ 35 en el momento de la biopsia.

Tasas de aborto espontáneo

Se produjeron 7 pérdidas en mujeres con embarazos con implantación, por lo que la tasa global de aborto espontáneo era del 6,9% (7/102 embarazos). Tres de estos siete embarazos correspondían a embarazos gemelares con la detección de dos ritmos cardiacos que se perdieron. También hubieron dos embarazos gemelares que se perdieron en los que sólo se detectó un polo fetal sin ritmo cardiaco. Dos embarazos simples se perdieron, uno sin ritmo cardiaco fetal y uno que se perdió después de documentarlo. Estas 7 pacientes tenían la edad media de 37,0 años en el momento de la recuperación de los embriones y todas tenían un historial de dos pérdidas anteriores, con la excepción de una que habían tenido tres. Sólo se analizaron los productos de la concepción en una de las pérdidas (gemelar). Éstas reportaron una trisomía 6 y un mosaico 45XO/46XX. Un nuevo análisis de ADN amplificado de la biopsia embrionaria con aCGH reveló el mismo diagnóstico euploide que con el DGP, lo que apunta hacia el mosaicismo como la causa de diagnóstico erróneo.

Se calculó la tasa esperada de pérdidas en las pacientes con pérdidas recurrentes en primer lugar según las tasas esperadas de Brigham et. al (basadas en la edad materna y pérdidas anteriores) (17, 18, 23) y una segunda vez según el método de la base de datos de la SART (basada en la edad y la localización de la clínica). Asimismo se detectó un aumento que no era significativo en la tasa de pérdida de embarazo entre las biopsias del día 3 (8,5%, 5/59 embarazos clínicos) y del día 5 (4,7%, 2/27 embarazos clínicos). Sin embargo, la tasa de pérdidas era mucho más bajo que la esperada según Brigham et. al (33,5%) y la SART (23,7%) tanto para biopsias del día 3 como las del día 5 (tabla 3). También hubo diferencia, pero no significativa, en la tasa de pérdida de embarazo cuando se compararon pacientes ≥ 35 años (8,5%, 6/70 embarazos clínicos) y < 35 años (3.3% 1/30 embarazos clínicos) y en ambos grupos la tasa de pérdida fue inferior a la esperada tanto según Brigham et. al y SART (tabla 4).

DISCUSIÓN

Los resultados tempranos obtenidos con DGP basado en la FISH (15-18) indicaban que la tasa de abortos espontáneos en pacientes con RPL idiopática se había reducido significativamente desde el 26% hasta el 10% en pacientes < 35 años, y desde el 39% hasta el 13% en pacientes mayores. No obstante, no se ha realizado más que un estudio aleatorizado con controles en esta población, que sorprendentemente no incluye datos sobre abortos espontáneos (21). Los resultados del DGP que se realiza hoy en día con la tecnología aCGH indican que se ha obtenido una disminución mayor de la tasa de abortos espontáneos en pacientes con RPL idiopática (desde el 5-7%). Esto se debe seguramente a una tasa inferior de errores en el diagnóstico con la nueva tecnología comparado con cuando se utilizaba la FISH, así como al hecho de poder analizar mayor número de cromosomas. En un estudio anterior, nuestro grupo comunicó una tasa de errores con FISH del 5% (34) comparado con el 2% con aCGH (25), técnica de análisis que detectó un 15% más de anomalías cromosómicas que la FISH con 12 sondas (35). Además la realización de la biopsia de trofoectodermo el día 5 permite examinar más células, lo cual disminuye aún más la tasa de errores asociados con mosaicismo (33).

La realización de la biopsia de trofoectodermo el día 5 ofrece claras ventajas sobre la biopsia el día 3 en cuanto a la tasa de embarazo, incluso con la transferencia de menor número de embriones. Los embriones que habían sobrevivido hasta el día 5 y eran susceptibles de biopsia tenía una probabilidad significativamente mayor de ser euploides comparados con todos los embriones del día 3. La biopsia de trofoectodermo en conjunto con el análisis con aCGH ofrecen la ventaja añadida de diagnóstico más fiable y más exacto ya que permite examinar mayor cantidad de ADN y mayor número de cromosomas (33). Además, estudios preliminares sugieren que a diferencia de la biopsia de embriones el día 3, la biopsia de blastocitos no ejerce ningún efecto nocivo sobre la implantación embrionaria (24, 36). Cuando se combina con el cribado completo de los cromosomas, tal y como se puede hacer con la aCGH, esta técnica puede aumentar de forma significativa la tasa de embarazo en comparación con grupos de controles (15-18). Las tasas de abortos espontáneos y de implantación en el grupo sometido a biopsia de embriones el día 5 eran mejores comparadas con los resultados del grupo sometido a biopsia el día 3, aunque la diferencia no fuera significativa. Es posible que con un tamaño muestral superior, estas diferencias lleguen a ser significativas. Cabe señalar que si el 18% de las pacientes sin embriones euploides según el DGP no se hubieran sometido al procedimiento, hubieran recibido la transferencia de un embrión aneuploide, lo cual hubiera desembocado o bien en un ciclo de FIV fallido con una tasa de embarazo significativamente inferior (43% [100/233]; P = 0,006) o, lo que es peor, en otra pérdida de embarazo. Con la implantación de estos embriones, lo tasa de pérdidas hubiera ascendido posiblemente hasta el 38%. Este estudio descriptivo ayuda a esclarecer  lo que se viene llamando RPL “sin etiología conocida” y demuestra claramente que en la mayoría de los casos la pérdida del embarazo se debe a la aneuploidía.

Este estudio presenta varias limitaciones. Se trata de un estudio descriptivo con algunas desventajas inherentes. Una de ellas es la ausencia de un grupo de control, lo cual imposibilita hacer asociaciones estadísticas. Es de esperar, no obstante, que el planteamiento de nuestra hipótesis haga posible realizar  estudios de investigación más sofisticados. Sigue siendo difícil determinar la composición del grupo de control más idóneo para pacientes con RPL. La situación se complica más si se toma en cuenta que se les ofrece DGP a la mayor parte de las pacientes con RPL en tratamiento con FIV, por lo que no se ha realizado ningún ensayo aleatorizado de control en pacientes con RPL. Algunos incluso considerarían no ético realizar un ensayo de esas características a la luz de los datos disponibles actualmente. Un estudio no aleatorizado sugeriría unas tasas más bajas de aborto espontáneo con el uso del DGP en esta población. Sin un grupo de control adecuado, es imposible comparar directamente la tasa de aneuploidía.

Otra limitación es la pérdida de datos para el seguimiento, y esto implica un sesgo de selección. Sin embargo, las pacientes para las que sí había datos sobre transferencias tenían características basales similares a las de la muestra en su conjunto, mientras las pacientes no incluidas en el seguimiento eran más jóvenes. Es posible que la inclusión de éstas últimas hubiera mejorado nuestros resultados. Los hallazgos de este estudio se pueden extrapolar a una población más amplia de pacientes con RPL ya que provienen de centros de todo el país (EEUU). No obstante, este mismo hecho implica que existe una gran variabilidad en protocolos de tratamientos y métodos de laboratorio que puede, a su vez, influir en los resultados y en las tasas de reproducción. La tasa general de abortos espontáneos en este estudio era reducida, lo cual dificulta comparaciones de métodos y comparaciones por edades.

Los resultados de este estudio confirman que la RPL idiopática se debe en la mayoría de los casos a anomalías cromosómicas con una tasa de abortos espontáneos residual del 6,9%. Estas pérdidas residuales demuestran que existen factores aparte de la aneuploidía, mosaicismo o anomalías genéticas no detectadas con la resolución de esta tecnología que pueden causar abortos espontáneos. Es posible que las nuevas tecnologías de aCGH y biopsia de blastocitos finalmente ofrezcan a pacientes con RPL no sólo una explicación sino también una cura.

Agradecimientos: Los autores quisieran agradecer al personal de embriología, enfermería y medicina de los centre de fertilidad que han prestado atención a las pacientes.