Técnicas invasivas y no invasivas en el diagnóstico de embriones humanos
The assisted reproduction techniques have been developed with the aim of increasing implantation rates and reducing the number of embryos transferred. Knowledge about embryonic morphology and the development of molecular technology applied to preimplantation diagnosis has resulted in great progress in terms of cycle performance, improving clinical outcomes and reducing the rate of abortion. The aim of this review is to describe embryonic diagnostic techniques. Currently, techniques like time-lapse applied to morphokinetics allow us to continuously study embryonic development providing a more dynamic approach. Molecular techniques such as directed metabolomics or proteomics show new elements of evaluation since the early stages of development to blastocyst. Studies on the metabolism of embryos cultured in-vitro are providing data that improve embryo selection. The development of diagnostic strategies and biomarkers associated with embryonic quality, aneuploidy and implantatory potential are new challenges for the future in reproductive medicine technology.
Cristina Calomarde González1:Luis Carmona Saborido2, Irene Guerra Juan1, Dácil Gutiérrez Pascual2, Adelaida Santana Martín2, Javier Domingo del Pozo2 1Máster en Biotecnología de la Reproducción Humana Asistida. Universidad de Valencia. Facultad de Medicina, 2IVI Las Palmas.
Palabras clave
Keywords
INTRODUCCIÓN
Más de 3 millones de bebés han nacido hasta la fecha con la ayuda de las técnicas de reproducción asistida (1). La mejora en las condiciones de cultivo y la reducción en el número de embriones a transferir en el mismo ciclo han dado como resultado un aumento de la tasa de implantación, reduciendo significativamente la incidencia de los embarazos múltiples, 22-29 % tras DET (double embryo transfer) y 1% tras eSET (elective single embryo transfer) (2,3). La evaluación morfológica clásica ha sido la variable con mayor peso en la elección de embriones a transferir, considerando al embrión como un elemento estático (4). Sin embargo, se desconoce estrictamente el grado de relevancia de algunos aspectos morfológicos del embrión como el grado de fragmentación, asimetría celular y multinucleación en la evolución posterior, aunque se ha descrito que la presencia de estas características es indicativa de mal pronóstico en su viabilidad futura. El cultivo hasta estadios de blastocisto ha despejado algunas dudas sobre la importancia de estos elementos morfológicos mejorando sensiblemente los procesos de selección embrionaria (5-8). Por otro lado, el avance en las técnicas de criopreservación revolucionó la manera de afrontar los tratamientos, mejorando así, el aprovechamiento tanto de gametos como de embriones para ciclos futuros. La tasa de embarazo acumulada se incrementó notablemente a raíz del desarrollo de las técnicas de vitrificación, permitiendo acumular ovocitos y embriones en pacientes diagnosticadas por baja respuesta, aumentando las tasas de supervivencia. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos de selección embrionaria basados en la caracterización de ritmos de división celular, conocimiento del genoma y biomarcadores, aportando una batería de datos que han mejorado sustancialmente los resultados clínicos. Por tanto, el objetivo de esta revisión es hacer un recorrido por las técnicas actuales de selección embrionaria y profundizar en la relevancia del secretoma embrionario y su repercusión clínica.
TÉCNICAS INVASIVAS
Diagnóstico genético preimplantacional
Las técnicas de diagnóstico invasivas, relacionadas fundamentalmente con el diagnóstico genético preimplantacional, conllevan la biopsia bien del ovocito (corpúsculo polar) o bien del embrión (blastómeras en D3 y trofoectodermo en día 5 o día 6). El análisis de ADN embrionario, para detectar anomalías cromosómicas y mutaciones genéticas, ha aumentado la tasa de implantación y reducido tanto la tasa de aborto espontáneo como de recién nacido vivo afecto por cromosomopatías o enfermedades monogénicas (9).
Las limitaciones técnicas del FISH (fluorescence in-situ hybridization) y del CGH (comparative genomic hybridization) se asocian con la incapacidad para analizar todos los cromosomas. Por esta razón, se desarrollaron los arrays de CGH, un método robusto y capaz de analizar los 24 cromosomas, así como desequilibrios cromosómicos menores de 5Mb, permitiendo la transferencia de los embriones en el mismo ciclo del análisis.
La PCR cuantitativa, además de aneuploidías, es capa de caracterizar mutaciones en un gen, pequeñas duplicaciones, deleciones y translocaciones desequilibradas, así como mutaciones de ADN mitocondrial (10).
La secuenciación masiva (NGS) (next generation sequencing) aplicada a la genética embrionaria, ha abierto la posibilidad de detectar alteraciones del ADN mitocondrial, enfermedades monogénicas, aneuploidías totales o parciales y síndromes asociados a microdeleciones en un sola ronda de análisis, con menor coste y mayor precisión que las plataformas de estudio anteriores (11-14). Esta técnica mejora incesantemente, aunque todavía no permite detectar reordenamientos cromosómicos equilibrados.
TÉCNICAS NO INVASIVAS
Tecnología time-lapse y morfocinética
La tecnología time-lapse asociada a la morfocinética permite realizar un análisis continuo del desarrollo embrionario bajo unas condiciones de cultivo muy estables (15).
Se han establecido algoritmos predictivos basados en la combinación de parámetros cinéticos y morfológicos que identifican los embriones con mayor poder implantatorio (16-19). Estos algoritmos se han construido en base a datos relacionados con el tiempo de división celular del embrión en sus primeros días de desarrollo. Además, se han descrito asociaciones entre parámetros morfocinéticos y la presencia de aneuploidías en el embrión (20, 21). La información obtenida tras la implantación de esta tecnología y las condiciones de cultivo estables han suscitado la importancia de estudiar el embrión de una manera dinámica. Fenómenos como la desaparición temprana de pronúcleos, absorción celular o la morulación temprana, que antes se desconocían o estaban muy poco estudiados, han sido descritos gracias a esta técnica.
METABOLÓMICA
La metabolómica es el estudio y comparación de los metabolomas, es decir, la colección de todos los metabolitos (moléculas de bajo peso molecular) presentes en una célula, tejido u organismo en el momento de estudio.
Desde hace dos décadas se estudia el metabolismo embrionario con el fin de correlacionar la actividad metabólica con la viabilidad embrionaria y la capacidad de implantación.
La metabolómica dirigida es la técnica que analiza metabolitos previamente identificados y de estructura conocida, así como su cuantificación, siendo la técnica más utilizada para el análisis del metabolismo embrionario.
Sobre el metabolismo de carbohidratos, Gardner y colaboradores en 1996, observaron que la conversión de glucosa a lactato fue menor en blastocistos viables que en no viables, lo que indicaba que los embriones viables tenían un metabolismo oxidativo mucho más alto y una producción de energía más eficiente (23). Cinco años después vieron que la morfología embrionaria no estaba relacionada con la actividad metabólica (23). También se describe que existe una disminución en los niveles de piruvato en el medio de cultivo hasta la etapa de mórula, sin embargo, es el consumo de glucosa en etapas posteriores el que desciende (24). Como curiosidad, en 2010, se determina que los embriones femeninos parecen tener una tasa mayor de utilización de glucosa que lo masculinos (25).
En el metabolismo embrionario también intervienen otras moléculas biológicas. Relacionado con la calidad y el potencial desarrollo del embrión está lo que se denomina como el turnover de aminoácidos. Se observó que los embriones que se desarrollaban hasta blastocisto mostraban un mayor consumo de leucina en el medio de cultivo, así como un patrón de utilización de aminoácidos diferente entre los que lograban y no lograban desarrollarse por completo hasta éste estadio (26). Aminoácidos como la asparagina, la glicina, la leucina y el glutamato han sido asociados con la tasa de embarazo y de recién nacido vivo (27, 28). En 2010, Picton y colaboradores detallaron diferencias en el turnover de aminoácidos en función del estado cromosómico del embrión (29).
La respiración embrionaria también es un parámetro metabolómico conocido, ya que se ha descrito una correlación entre el consumo de oxígeno, la calidad morfológica del embrión y la tasa de embarazo. En 2012, Tejera y colaboradores determinaron que la viabilidad embrionaria estaba asociada a una mayor tasa de consumo de oxígeno por parte del embrión (30).
Existe la hipótesis del embrión “tranquilo”, que correlaciona el metabolismo embrionario y su viabilidad, afirmando que los embriones con mayor potencial de desarrollo mantienen un nivel metabólico bajo con el fin de minimizar el consumo de energía y la producción de especies reactivas de oxígeno (31). No obstante, varios estudios aportan datos sugiriendo que la viabilidad embrionaria está asociada con un aumento de la actividad metabólica (32, 33).
La asociación de ciertos perfiles metabólicos con un determinado grado de desarrollo evidenció la posibilidad de definir la huella metabólica que permitiría asociar el metaboloma a un grado de morfología embrionaria, así como al potencial de implantación.
En 2013, Vergouw y colaboradores presentaron un nuevo algoritmo predictivo basado en el perfil metabolómico a partir de los medios de cultivo de embriones transferidos individualmente. En este estudio, los autores observaron que embriones con una morfología similar podían mostrar perfiles metabólicos diferentes y por tanto diferentes catalogaciones. Cabe destacar que en la mayoría de estos estudios los metabolitos individuales no fueron identificados, sino que el índice de viabilidad fue creado en base al perfil metabolómico general. Hasta la fecha, la validez de estos algoritmos frente a la evaluación morfológica convencional no ha demostrado una mejora de la tasa de embarazo (34, 35).
PROTEÓMICA
La proteómica es el estudio y comparación de los proteomas, es decir, el conjunto de todas las proteínas y sus propiedades (niveles de expresión, modificaciones post-transcripcionales, interacciones, etc) expresadas en una célula, tejido u organismo en el momento concreto de estudio. A su vez, el secretoma embrionario se define como aquellas proteínas producidas y secretadas por el embrión al medio de cultivo, siendo una herramienta útil para obtener información sobre los procesos de embriogénesis temprana y la viabilidad del desarrollo posterior.
Actualmente, han sido identificadas moléculas del secretoma embrionario asociadas con diferentes funciones, siendo la característica común la modulación del proceso de implantación. (Tabla 1).
El factor activador de plaquetas, particularmente, no está asociado con la viabilidad embrionaria (36). En cambio la leptina, si está relacionada con el desarrollo hasta estadio de blastocisto, observándose una menor secreción de leptina en los embriones evolutivos (37, 38).
Además, se han descrito un grupo de moléculas como la proteína soluble que regula la expresión de HOXA10, el hCG y el antígeno leucocitario humano G soluble (sHLA-G), que se relacionan con la viabilidad embrionaria y el potencial de implantación del embrión (39-42). Aunque existen estudios que reportan embarazos por embriones sHLA-G indetectables o negativos (43, 44).
El grupo de Gardner y colaboradores en 2006, observó y determinó que la ubiquitina aparecía poco expresada en embriones bloqueados (45). Dos años más tarde, este mismo grupo, determinó que existía una disminución de las proteínas CXCL13 y el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos en los medios de blastocistos que habían implantado previamente (46). En 2011, McReynolds y colaboradores describieron que la lipocalina-1 aumenta su expresión en blastocistos humano aneuploides, caracterizando esta proteína como el primer biomarcador para la detección no invasiva de aneuploidias (47). Este conjunto de biomoléculas aporta una información detallada de los procesos que ocurren en el metabolismo proteico durante el cultivo in-vitro. No obstante, en algunos ejemplos la información que aportan no es totalmente precisa y se requiere de más estudios para valorar estos indicadores y su relación con el potencial de implantación.
CONCLUSIONES
Los avances técnicos en medicina reproductiva durante los últimos veinte años han dado como resultado un aumento destacable en las tasas de implantación. En esta revisión, se han descrito nuevos elementos de evaluación embrionaria que podrían hacer reflexionar sobre los criterios clásicos de estudio. La evaluación morfológica es la característica de estudio de mayor relevancia, sin embargo, solo con este método no se garantiza el embarazo. La incorporación de técnicas de análisis cromosómico junto con la morfocinética ha permitido una mejora en las tasas de implantación. La búsqueda de biomarcadores predictivos podría ayudar a seleccionar el mejor embrión a transferir. Profundizar en el conocimiento del proteoma y el metaboloma embrionario está dando pistas sobre la capacidad y la viabilidad de los embriones a largo plazo, mostrando resultados prometedores. Describir la huella metabólica de los embriones potencialmente viables es uno de los retos que en este campo quedan por definir. Existen todavía dudas sobre la relevancia clínica de estas moléculas biológicas y si de forma rutinaria podrían incorporarse al diagnóstico clínico a tiempo real, así como la relación de coste-efectividad que presentan.
2. Gerris JM. Single embryo transfer and IVF/ICSI outcome: a balanced appraisal. Hum Reprod Update 2005:11;105-121.
3. McLernon DJ, Harrild K, Bergh C, Davies MJ, de Neubourg D, Dumoulin JC, Gerris J, Kremer JA, Martikainen H and Mol BW. Clinical effectiveness of elective single versus double embryo transfer: meta-analysis of individual patient data from randomised trials. BMJ 2010:341;c6945.
4. Montag M, Liebenthron J and Koster M. Which morphological scoring system is relevant in human embryo development?. Placenta 2011;32 Suppl 3;S252-6.
5. Fragouli E, Alfarawati S, Spath K and Wells D. Morphological and cytogenetic assessment of cleavage and blastocyst stage embryos. Mol Hum Reprod 2014:20;117-126.
6. Alfarawati S, Fragouli E, Colls P, Stevens J, Gutierrez-Mateo C, Schoolcraft WB, Katz-Jaffe MG and Wells D. The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender. Fertil Steril 2011:95:520-524.
7. Capalbo A, Rienzi L, Cimadomo D, Maggiulli R, Elliot T, Wright G, Nagy ZP and Ubaldi FM. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocyst. Hum Reprod 2014:29;1173-1181.
8. Rubio C, Rodrigo L, Mercader A, Mateu E, Buendia P, Pehlivan T, Viloria T, De los Santos MJ, Simón C, Remohí J et al. Impact of chromosomal abnormalities on preimplantation embryo development. Prenat Diagn 2007:27:748-756.
9. Werlin L, Rodi I, DeCherney A, Marello E, Hill D and Munne S. Preimplantation genetic diagnosis as both a therapeutic and diagnotic tool in assisted reproductive technology. Fertil Steril 2003:80;467-468.
10. Gardner DK, Meseguer M, Rubio C and Treff NR. Diagnosis of human preimplantation embryo viability. Hum Reprod Update 2015.
11. Fiorentino F, Biricik A, Bono S, Spizzichino L, Cotroneo E, Cottone G, Kokocinski F and Michel CE. Development and validation of next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertil Steril 2014:101;1375-1382.
12. Fiorentino F, Bono S, Biricik A, Nuccitelli A, Cotroneo E, Cottone G, Kokocinski F, Michel CE, Minasi MG and Greco E. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Hum Reprod 2014:29;2802-2813.
13. Treff NR, Fedick A, Tao X, Devkota B, Taylor D and Scott RT, Jr. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertil Steril 2013:99;1377-1384.e6.
14. Yin X, Tan K, Vajta G, Jiang H, Tan Y, Zhang C, Chen F, Chen S, Zhang C, Pan X et al. Massively parallel sequencing for chromosomal abnormality testing in trophectoderm cells of human blastocysts. Biol Reprod 2013:88;69.
15. Kirkegaard K, Ahlstrom A, Ingerslev HJ and Hardarson T. Choosing the best embryo by time lapse versus standard morphology. Fertil Steril 2015:103;323-332.
16. Lemmen JG, Agerholm I and Ziebe S. Kinetic markers of human embryo quality using time-lapse recordings of IVF/ICSI-fertilized oocytes. Reprod Biomed Online 2008:17;385-391.
17. Meseguer M, Herrero J, Tejera A, Hilligsoe KM, Ramsing NB and Remohí J. The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum Reprod 2011:26;2658-2671.
18. Wong CC, Loewe KE, Bossert NL, Behr B, De Jonge CJ, Baer TM and Reijo Pera RA. Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat Biotechnol 2010:28;1115-1121.
19. Kaser DJ and Racowsky C. Clinical outcomes following selection of human preimplantation embryos with time-lapse monitoring: a systematic review. Hum Reprod Update 2014:20;617-631.
20. Campbell A, Fishel S, Bowman N, Duffy S, Sedler M and Hickman CF. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online 2013:26;477-485.
21. Rienzi L, Capalbo A, Stoppa M, Romano S, Maggiulli R, Albricci L, Scarica C, Farcomeni A, Vajta G and Ubaldi FM. No evidence of association between blastocyst aneuploidy and morphokinetic assessment in a selected population of poor-prognosis patients: a longitudinal cohort study. Reprod Biomed Online 2015:20;57-66.
22. Lane M and Gardner DK. Selection of viable mouse blastocyst prior to transfer using a metabolic criterion. Hum Reprod 1996:11;1975-1978.
23. Gardner DK, Wale PL, Collins R and Lane M. Glucose consumption of single post-compaction human embryos is predictive of embryo sex and live birth outcome. Hum Reprod 2011:26;1981-1986.
24. Gardner DK, Lane M, Stevens J and Schoolcraft WB. Noninvasive assessment of human embryo nutrient consumption as a measure of developmental potential. Fertil Steril 2001:76;1175-1180.
25. Gardner DK, Larmen MG and Thouas GA. Sex-related physiology of the preimplantation embryo. Mol Hum Reprod 2010:16;539-547.
26. Houghton FD, Hawkhead JA, Humpherson PG, Hogg JE, Balen AH, Rutherford AJ and Leese HJ. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Hum Reprod 2002:17;999-1005.
27. Brison DR, Houghton FD, Falconer D, Roberts SA, Hawkhead J, Humpherson PG, Lieberman BA and Leese HJ. Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod 2004:19;2319-2324.
28. Seli E, Botros L, Sakkas D and Burns DH. Noninvasive metabolomics profiling of embryo culture media using proton nuclear magnetic resonance correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 2008:90;2183-2189.
29. Picton HM, Elder K, Houghton FD, Hawkhead JA, Rutherford AJ, Hogg JE, Leese HJ and Harris SE. Association between amino acid turnover and chromosome aneuploidy during human preimplantation embryo development in vitro. Mol Hum Reprod 2010:16;557-569.
30. Tejera A, Herrero J, Viloria T, Romero JL, Gamiz P and Meseguer M. Time-dependent O2 consumption patterns determined optimal time ranges for selecting viable human embryos. Fertil Steril 2012:98;849-57.e1-3.
31. Baumann CG, Morris DG, Sreenan JM and Leese HJ. The quiet embryo hypothesis: molecular characteristics favoring viability. Mol Reprod Dev 2007:74;1345-1353.
32. Hardy K, Hooper MA, Handyside AH, Rutherford AJ, Winston RM and Leese HJ. Non-invasive measurement of glucose and pyruvate uptake by individual human oocytes and preimplantation embryos. Hum Reprod 1989:4;188-191.
33. Gott AL, Hardy K, Winston RM and Leese HJ. Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryos. Hum Reprod 1990:5;104-108.
34. Vergouw CG, Botros LL, Roos P, Lens JW, Schats R, Hompes PG, Burns DH and Lambalk CB. Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to asses embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Hum Reprod 2008:23;1499-1504.
35. Vergouw CG, Kieslinger DC, Kostelijk Eh, Botros LL, Schats R, Hompes PG, Sakkas D and Lambalk CB. Day 3 embryo selection by metabolomics profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology: a randomized controlled trial. Hum Reprod 2012:27;2304-2311.
36. O´Neill C. The role of paf in embryo physiology. Hum Reprod Update 2005:11;215-228.
37. Gonzalez RR, Caballero-Campos P, Jasper M, Mercader A, Devoto L, Pellicer A and Simon C. Leptin and leptin receptor are expressed in the human endometrium and endometrial leptin secretion is regulated by the human blastocyst. J Clin Endocrinol Metab 2000:85;488-4888.
38. Cervero A, Horcajadas JA, Dominguez F, Pellicer A and Simon C. Leptin system in embryo development and implantation: a protein in search of a function. Reprod Biomed Online 2005:10;217-223.
39. Sakkas D, Lu C, Zulfikaroglu E, Neuber E and Taylor HS. A soluble molecule secreted by human blastocysts modulates regulation of HOAX10 expression in an epithelial endometrial cell line. Fertil Steril 2003:80;1169-1174.
40. Butler SA, Luttoo J, Freire MO, Abban TK, Borrelli PT and Iles RK. Human chorionic gonadotropin (hCG) in the secretoma of cultured embryos: hyperglycosylated hCG and hCG-free beta subunit are potential markers for infertility management and treatment. Reprod Sci 2013:20;1038-1045.
41. Fuzzi B, Rizzo R, Criscuoli L, Noci I, Melchiorri L, Scarselli B, Bencini E, Menicucci A and Baricordi OR. HLA-G expression in early embryos is fundamental prerequisite for the obtainment of pregnancy. Eur J Immunol 2002:32;311-315.
42. Noci I, Fuzzi B, Rizzo R, Melchiorri L, Criscuoli L, Dabizzi S, Biagiotti R, Pellegrini S, Menicucci A and Baricordi OR. Embryonic soluble SLA-G as a marker of developmental potential in embryos. Hum Reprod 2005:20;138-146.
43. Tabiasco J, Perrier d´Hauterive S, Thonon F, Parinaud J, Leandri R, Foidart JM, Chaouat G, Munaut C, Lombroso R, Selva J et al., Soluble HLA-G in IVF/ICSI embryo culture supernatants does not always predict implantation success: a multicenter study. Reprod Biomed Online 2009:18;374-381.
44. Sargent I, Swales A, Ledee N, Kozma N, Tabiasco J and Le Bouteiller P. sHLA-G production by human IVF embryos: can it be measured reliably? J Reprod Immunol 2007:75;128-132.
45. Katz-Jaffe Mg, Schoolcraft WB and Gardner DK. Analysis of protein expression (secretoma) by human and mouse preimplantation embryos. Fertil Steril 2006:86;678-685.
46. Dominguez F, Gadea B, Esteban FJ, Horcajadas JA, Pellicer A and Simon C. Comparative protein-profile analysis of implanted versus non-implanted human blastocysts. Hum Reprod 2008:23;1993-2000.
47. McReynolds S, Vanderlinden L, Stevens J, Hansen K, Schoolcraft WB and Katz-Jaffe MG. Lipocalin-1: a potential marker for non-invasive aneuploidy screening. Feril Steril 2011:95;2631-2633.
Edición Nº 37.JULIO-DICIEMBRE 2020
