Análisis de la dinámica de la fragmentación de ADN en espermatozoides para la optimización de la Inseminación Artificial Intrauterina

INTRODUCCIÓN

    El estudio de la fragmentación del ADN en el semen es un tema de gran interés actual y existen varias revisiones que recogen los frutos de una investigación muy activa en los campos de la andrología, la fertilidad, la reproducción y también en el campo de la ciencias básicas, dado que la estructura de la cromatina en el espermatozoide es todavía desconocida (1- 6).

    La presencia de ADN fragmentado en el eyaculado humano está bien documentada, sobre todo en varones con baja calidad espermática (7-9). Hay trabajos que refieren un mayor porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado en el semen de varones subfértiles, lo que ha originado una serie de publicaciones sobre la relación entre la fragmentación de ADN y resultados en reproducción asistida. Las bases que definen la fragmentación de ADN en células espermáticas maduras no se conocen con el detalle que se requiere. Los mecanismos que producen el daño están en parte identificados, pero la procedencia del daño, una vez que éste se localiza en el espermatozoide maduro no se puede identificar con facilidad. Se han propuesto tres hipótesis principales que explicarían la presencia de ADN fragmentado en el espermatozoide.

En la primera se relaciona la existencia de roturas en la cadena del ADN en células maduras con el intercambio del complejo de histonas por el de protaminas que ocurre en el proceso de la espermiogénesis (10). Este intercambio, dirigido a conseguir una mayor compactación de la molécula de ADN, genera cierto nivel de estrés en la torsión de la molécula de ADN, dado que existe un súper-enrollamiento heredado de la presencia de histonas. Para eliminar este tipo de tensiones y facilitar el reemplazamiento de las histonas por protaminas se generan un cierto nivel de roturas en las moléculas de ADN que serán posteriormente reparadas (11).

La segunda hipótesis implica al proceso apoptótico. Con el concurso de enzimas nucleolíticas se generarían roturas de cadena doble en la molécula de ADN (12-14), de manera similar a lo que puede ocurrir en las células somáticas (15).

La tercera hipótesis propone que la fragmentación del ADN es la consecuencia de un exceso de estrés oxidativo en el tracto reproductivo masculino. Los altos niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS), podrán ser consecuencia de su liberación por los leucocitos activados y / o macrófagos, por ejemplo, frente a una respuesta inflamatoria generada ante un proceso infeccioso. La presencia de células inmaduras en el eyaculado y que mantienen cantidades excesivas de citoplasma, como por ejemplo la presencia de gotas citoplasmáticas proximales o distales (16-20), pueden también contribuir a provocar altos niveles de oxidación de tipo endogéno en este caso. El estrés oxidativo puede desencadenarse cuando la producción de ROS supera la actividad de los agentes antioxidantes presentes en el plasma seminal, incluyendo enzimas tales como la superóxido dismutasa, la catalasa o la glutatión peroxidasa, así como agentes que bloquean la cascada de reacciones redox (19). Normalmente este tipo de daño suele generar daños en las bases y roturas en una de las dos hebras de la doble cadena del ADN.

Finalmente, debemos tener en cuenta que la presencia de ADN fragmentado en un espermatozoide maduro puede ser el resultado de procesos combinados, dado que los mecanismos propuestos en las tres hipótesis no son excluyentes y lo más probable es que no operan como fenómenos aislados. Por ejemplo, se podría asumir que el proceso apoptótico y el daño generado por ROS puedan estar asociados y lo mismo podría ocurrir tras un proceso de espermiogénesis anormal con acumulación de roturas, hecho que podría ser detectado por el proceso de señalización de la apoptosis. Adicionalmente a todo este tipo de procesos en los que se produce un incremento en las tasas basales de daño espermático, el manejo de los espermatozoides de forma extracorporal, pueden generar también cierto daño en el ADN.

Las técnicas de preparación espermática para reproducción asistida (TRA) implican centrifugación de las muestras, y se ha considerado en numerosos trabajos que pueden ocasionar un daño espermático iatrogénico que pueden afectar a los resultados de gestación (21,22). El mecanismo sugerido para este efecto es la generación de especies reactivas de oxígeno de 2 a 5 veces mayor en los cinco primeros minutos (23). Como el nivel de estrés oxidativo incrementa los niveles de daño en el ADN espermático, se podría pensar que técnicas de lavado de semen como el swim-up podrían afectar negativamente al porcentaje de espermatozoides con ADN alterado.

Se han utilizado diversos métodos para conocer el índice de fragmentación (IF) de las muestras de semen antes y después de realizar el swim-up, que incluyen el test de dispersión de la cromatina (SCD), encontrándose en algunos de ellos una correlación negativa entre la tasa de fecundación y calidad embrionaria con el IF (24). Sin embargo, en todos ellos se ha considerado el IF como un valor estático, determinado en un tiempo concreto, sin tener en cuenta su dinámica.

Nuestro grupo de trabajo ha demostrado recientemente que el proceso de la fragmentación del ADN espermático no sólo no es un proceso estático y fruto de cuyo análisis se le pueda asignar a cada individuo un valor inamovible para los niveles de fragmentación, sino que, por el contrario, es un proceso dinámico y muy correlacionado con el tiempo que transcurre desde el momento de la eyaculación. El resultado es que existe una tendencia hacia un aumento del ADN dañado y en espacios de tiempo relativamente cortos. (25, 26).

Por otra parte, la inseminación intrauterina con semen de la pareja (IUI) es un tratamiento que se utiliza con frecuencia en una gran variedad de indicaciones, sobre todo en esterilidad de origen desconocido (EOD), factor masculino leve, factor tubárico unilateral, y desórdenes ovulatorios. Se han propuesto diversos factores pronósticos para la consecución de gestación con IUI, entre los que destacan la edad de la mujer (27), número de folículos ,tipo de estimulación (28), e incluso grado de fragmentación del ADN (29). Sin embargo, en relación con este último factor, ningún trabajo ha relacionado la dinámica de la fragmentación del ADN con los resultados de esta técnica.

El principal objetivo de este trabajo es evaluar, de forma prospectiva,  como afecta el procesamiento del semen para Reproducción Asistida en la viabilidad espermática. Para ello, se compara la dinámica de fragmentación de ADN en muestras de semen que van a utilizarse para inseminación artificial intrauterina (IUI) antes y después del  swim-up.  El segundo objetivo es conocer el valor predictivo de la dinámica de fragmentación espermática en el resultado de la inseminación intrauterina en términos de embarazo clínico.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

 

Pacientes

Las muestras de semen de este estudio provienen de parejas en tratamiento de IUI obtenidas el mismo día de la inseminación en la Clínica Tambre. Solo se incluyeron los primeros ciclos de tratamiento, y la alícuota de semen utilizada para el estudio provenía del primer día de inseminación, teniendo en cuenta que en la Clínica Tambre realizamos dos días de inseminación. Se incluyeron en el estudio 25 parejas cuyos varones presentaron el día de la inseminación más de 6 millones de espermatozoides por ml recuperados post swim-up. Todos los varones mantuvieron entre 3 y 5 días de abstinencia sexual antes de la inseminación.

El rango de edad de las mujeres incluidas en el estudio osciló entre 28 y 35 años. El diagnóstico de estas parejas es esterilidad de origen desconocido y sin factor masculino severo.

 

Preparación de semen

Los parámetros espermáticos se determinaron después de licuación a 37º C durante 30 minutos. La concentración espermática y la movilidad se determinaron en una cámara Makler (Sefi Laboratories,  Tel Avil, Israel), siguiendo las normas de la OMS (1999). El tiempo T0 se considera a partir de 30 minutos, momento en el cual se comienza a preparar la muestra.

Todas las muestras se prepararon por swim-up. Los eyaculados fueron diluidos 1:1 (v/v) con Sperm Médium (MediCult, Jyllinge, Denmark), se centrifugaron durante 5 minutos a 300 g y se retiró el sobrenadante. Posteriormente, y con cuidado para no deshacer el sedimento, se añadieron 0,5 ml de medio (IVF Médium, MediCult, Jyllinge, Denmark). Cada muestra se colocó en el incubador a 37ºC y atmósfera de 5% de CO2 en un ángulo de 45º durante 1 hora. Después de este tiempo, se retiraron los 0,5 ml superiores. Se utilizaron alícuotas de 20 microlitros para el análisis de la movilidad, recuento, morfología e IF. El resto de la muestra se utilizó para realizar la inseminación intrauterina. En la tabla 1 se refleja la media de los datos de movilidad y concentración de estas muestras.

Se recogieron alícuotas a T0 y a las 1, 2, 4 y 6 horas tanto en las muestras en fresco como  tras el swim-up. En todos los casos las muestras se mantuvieron en el incubador a 37ºC y atmósfera de 5% de CO2.

En la tabla 1 se refleja los datos de movilidad y concentración de estas muestras.

Estimulación ovárica

Todos los ciclos se estimularon con FSH recombinante (FSHr, Gonal-F; Merck- Serono, S.A, Spain). La estimulación comenzó en el día 3 del ciclo con 75-150 UI de FSHr diaria. La maduración folicular fue monitorizada por ecografía vaginal seriada y niveles plasmáticos de estradiol. Cuando el diámetro del folículo dominante era mayor de 18 mm, las pacientes recibieron 250 g de hCG recombinante (Ovitrelle, Merck Serono, S.A, Spain). Se realizaron dos inseminaciones consecutivas a las 12 y 36 horas después de la inyección de hCG. La fase lútea se suplementó con progesterona vaginal diaria (100 mg) (Progeffik, Effik). Dos semanas después de la inseminación se determinaron los niveles plasmáticos de beta hCG. El embarazo clínico se definió como la visualización ecográfica de un saco gestacional intrauterino.

 

Determinación de la fragmentación de ADN

La determinación de la fragmentación del ADN antes y después del swim-up se realizó mediante la técnica  Sperm Chromatin Dispersión – SCD – (Halosperm; Halotech –DNA S.L., Madrid, España). Las muestras de semen se diluyeron hasta alcanzar una concentración de entre 5 y 10 millones de espermatozoides por mililitro. Las muestras procesadas con Halosperm se tiñeron para ser visualizadas con microscopía de florescencia utilizando una combinación de fluorochromos para teñir el ADN en rojo/verde (Gel-Red/Eva Green –Biotiun, USA) y para las proteínas en verde (Mercuribromofluoresceina, Sigma, USA). El conteo se realizó en 300 espermatozoides utilizando un microscopio motorizado Leica DMLB que elegía los campos en un microscopio al azar según un movimiento de coordenadas predefinido. Los datos se procesaron en Excell (Microsoft, USA) y los análisis estadísticos se realizaron con SPSS para Windows v. 11,5. La representación gráfica de los resultados se realizó con Apple Keynoteº 4.0.4 y Apple grapherº 2.0 para la elaboración de las curvas de regresión logística.

El SCD utiliza un tratamiento doble encaminado a producir, primero una desnaturalización del ADN, utilizando como punto de partida las roturas presentes en la molécula de ADN, bien afecten a doble cadena o a cadena sencilla, y segundo un tratamiento de desproteinización controlada. Tras la tinción, los espermatozoides que presentan el ADN fragmentado no presentan un halo visible de dispersión de la cromatina o si lo hacen este es de muy pequeño tamaño. Los espermatozoides que presentan un halo de dispersión grande se consideran normales para el nivel de fragmentación.

 

Morfología de halos

De acuerdo con la morfología de halos que genera Halosperm tras tinción para microscopía de fluorescencia, la identificación y discriminación de aquellos espermatozoides que contienen ADN fragmentado (ausencia de halo de dispersión de la cromatina) de los que lo presentan no fragmentado (presencia de halo de dispersión de la cromatina) es fácil de discriminar (Figura 1a). De hecho, en tiempos cortos de incubación la mayoría de los espermatozoides muestran un halo de dispersión patente (Figura 1a), mientras que este desaparece cuando los tiempos de incubación se maximizan (Figura 1b). La utilización de determinados filtros electrónicos ejecutados directamente sobre las imágenes capturadas en el microscopio, ayudan en la discriminación de los diferentes tipos de espermatozoides tras el SCD (comparar figuras 1a,b con 1c,d).

Es interesante resaltar que dentro de los tipos morfológicos identificados como dañados se pueden establecer dos categorías muy clara y que se diferencian con nitidez de los espermatozoides normales que presentan un halo de dispersión de gran tamaño (Figura 2a y Figura 3a): aquellos que presentan ausencia de halo o este es muy pequeño (Figura 2b y Figura 3b) y otro tipo morfológico identificado como degradado y que presenta una cabeza de pequeño tamaño y difusa (Figura 2c). Este último tipo se denominará espermatozoide degradado.

RESULTADOS

Dinámica de la fragmentación antes y después del swim-up.

En condiciones basales (T0) las muestras de semen tras Swim-up muestran una media en los niveles de fragmentación de 18,6 ± 6,5. Estos niveles de fragmentación son significativamente inferiores a las muestras analizadas en fresco (29,5 ± 9,1). (Figura 4) Esta circunstancia ocurre de forma paralela en cada uno de los intervalos de incubación analizados (Figura 5, 6 y Tabla 2).

En ambos grupos la evolución temporal de los índices de fragmentación es compatible con un modelo de regresión lineal (en ambos casos p<0,001). En el intervalo analizado, los datos obtenidos también son explicables mediante modelos de regresión logarítmica y exponencial (p<0,001 en todos los casos) (Figura 7).

En el comportamiento del semen fresco el modelo de regresión lineal es el que tiene una mayor capacidad predictiva, calculada mediante la Rsq corregida (Figura 7).

Este modelo nos permite afirmar el mejoramiento del índice de fragmentación basal en el semen capacitado de un 33% respecto al fresco, sin aumento de su velocidad de fragmentación (Fresco: y=30,87+3,06x; Capacitado: y= 20,46+2,67x)

En el caso del semen capacitado la capacidad predictiva del modelo de regresión lineal es superior al modelo de regresión logarítmica y muy similar (aunque algo inferior) al de regresión exponencial. El uso en ambos casos de un modelo de regresión lineal simplifica la interpretación y permite comparar la evolución de ambos grupos. En nuestros casos observamos diferencias significativas en la constante del modelo o punto basal pero no encontramos diferencias en la velocidad de fragmentación que ambos grupos experimentan. En modo alguno la degradación del ADN en el grupo post swim-up es más rápida que en el pre swim-up, sino más bien apunta (aunque sin significación estadística) a lo contrario. Básicamente lo que se observa es que tras SU el índice de fragmentación de la muestra se reduce un 10% (pasando de casi un 30% a un 20 %). Dicho índice de fragmentación aumenta linealmente con el tiempo a un ritmo similar en ambos grupos de un 3% por cada hora transcurrida, manteniendo a lo largo del estudio la misma diferencia del IF entre ambos grupos.

 

Dinámica de la fragmentación en relación con la gestación

Del total de las 25 inseminaciones intrauterinas realizadas se han obtenido 8 gestaciones clínicas (32%). Se ha realizado el estudio comparativo de la dinámica de fragmentación en los 8 casos con gestación frente a los 17 en los que no se ha conseguido.

La tasa de fragmentación en muestras de semen fresco es similar en el grupo que consiguió embarazo y en el que no (Figura 6; p>0,3). En lo que se refiere a las tasas de embarazo conseguidos tras analizar el comportamiento dinámico tras Swim-up, se observa que el grupo que obtuvo gestación presentaba un índice de fragmentación basal significativamente inferior al que no la obtuvo (p:0,048), y se obtuvieron diferencias muy próximas a la significación estadística al cabo de una hora de incubación (p: 0,053). Es decir, existen indicios que sugieren que las dinámicas de fragmentación de menor nivel basal producirían embarazos con mayor facilidad. Sin embargo, dichas diferencias habían desaparecido completamente a las dos horas de la incubación (Figura 8; p>0,8).

DISCUSIÓN

Los resultados de este trabajo apoyan la idea, ya publicada por otros autores (30), de que la centrifugación que conlleva el swim-up, como práctica de rutina en el laboratorio de reproducción asistida, no induce un daño adicional al ADN espermático. Por el contrario, según estos resultados, el índice de fragmentación tras una hora de incubación de la muestra de semen post-swim-up muestra valores significativamente menores de IF en todas las muestras analizadas, con una media de un 10% de mejora. Este hecho, ya de por sí, es de vital importancia, ya que el tiempo máximo que se recomienda para tener una muestra en el incubador después del swim-up, es de una hora.  Sin embargo, la novedad de este estudio reside en el análisis dinámico del índice de fragmentación. Y los resultados demuestran, que no solamente mejora este IF en todos los tiempos estudiados (0, 1, 2, 4 y 6 horas) tras el swim-up, sino que la velocidad de fragmentación del ADN espermático es similar en ambos casos: antes y después de preparar las muestras de semen para inseminación.

El hecho de elegir estos tiempos concretos para analizar el IF post swim-up ha sido en base a la práctica clínica: existen circunstancias ligadas a la labor asistencial en determinados centros de reproducción asistida que impiden utilizar las muestras para IUI antes de un tiempo determinado. Con estos resultados demostramos que, tras 4 horas de incubación y aún más, después de 6 horas, la media de fragmentación de la muestra de semen es cercana al 50%, lo que puede dificultar enormemente la consecución de embarazo.

Respecto a la relación entre gestación e índice de fragmentación se han publicado numerosos trabajos, muchas veces contradictorios. En unos casos se han relacionado tasa de fecundación, calidad embrionaria y resultados de FIV con un alto IF (31), mientras que en otros no se ha encontrado una correlación (32).

Parece más lógico pensar que en el caso de la inseminación intrauterina, donde no se realiza una selección espermática tan drástica como la que se realiza con microinyección intracitoplasmática (ICSI), podría haber una relación. Sin embargo, hasta la fecha se han publicado pocos trabajos que demuestren la utilidad del análisis de la fragmentación de ADN espermático con la predicción de embarazo en IUI. Duran y col (29) encontraron, en un estudio prospectivo utilizando TUNEL que las muestras que originaban embarazo tenían menos porcentaje de fragmentación que las que no habían conseguido gestación. Ellos compararon tasa de gestación en muestras preparadas con gradientes de densidad. Además, los ciclos incluidos en el estudio eran naturales, con citrato de clomifeno y FSH, haciendo así difícil comparar sus resultados con los nuestros, y quizás, explicando la baja tasa de gestación que obtenían (8,7% por ciclo).

En otro estudio, Bungum y col (33), utilizando el SCSA con un punto de corte previo de <27%, encontraron diferencias considerables entre la tasa de embarazo de las muestras por debajo y por encima de estos límites (20,2% frente 4% respectivamente), aunque sin significación estadística. Sin embargo, este trabajo enfocaba el índice de fragmentación en muestras en fresco, sin analizar lo que ocurría después del swim-up.

Un trabajo más completo, en el que se analizaron muestras de semen teniendo en cuenta los valores post swim-up (32) con la técnica del SCD, no se encontró mejoría en los índices de fragmentación antes y después del swim-up, ni tampoco se halló correlación entre SCD y resultado de embarazo en IUI. Sin embargo, como ellos mismos reconocen en su trabajo, quizás los resultados serían diferentes al utilizar las mismas muestras que se utilizan el día de la inseminación. Además, en ninguno de los estudios publicados hasta el momento se ha realizado un estudio dinámico del índice de fragmentación en IA, lo cual, como demuestran los resultados de trabajos previos, es de vital importancia. (34). Si como se ha comentado al principio, es recomendable utilizar las muestras de semen post swim-up para inseminación en un intervalo de una hora, la diferencia en el IF entre muestras de semen que han conseguido gestación y las que no, en las dos primeras horas, podría emplearse como índice pronóstico en un estudio previo de rutina de los varones que van a realizar ciclos de IUI.

Las limitaciones de este trabajo vienen dadas por el bajo número de ciclos incluidos, así como por los factores asociados al éxito de la IUI. Aunque hemos intentado incluir parejas afines, con una edad de la mujer por debajo de 35 años y sin factor masculino, los resultados podrían verse afectados por causas desconocidas en la EOD que interfieran en la consecución de la gestación.

En cualquiera de los casos parece altamente recomendable que las muestras seminales se procesen con celeridad tras la eyaculación y que se pueda conseguir una reducción de la frecuencia de fragmentación del ADN espermático tras un proceso de selección. En resumen, las conclusiones, desde un punto de vista práctico que se desprenden de este trabajo son: