Diagnóstico genético preimplantación de aneuploidías: de la FISH a la secuenciación masiva

ANTECEDENTES, EL CONCEPTO DE "SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS"

La aparición de las técnicas de fecundación in vitro (FIV) a finales de los años 70, permitió ofrecer una acción terapéutica eficaz a las parejas infértiles/subfértiles. Desde entonces, la evolución del conocimiento en esta área ha permitido el nacimiento de más de cinco millones de niños en el mundo y es una prestación incluida en la mayoría de los sistemas sanitarios de los países desarrollados. No obstante, independientemente de la etiología que oriente la indicación de las técnicas de reproducción asistida (TRA), existe lo que podríamos llamar un “factor embrionario” sobre el que no podemos actuar más que a nivel observacional. Muy poco tiempo después de la aplicación de las técnicas de FIV aparecieron los primeros trabajos en los que se destacaba una elevada incidencia de pérdidas posimplantación en embarazos de FIV (1, 2). Por otro lado, algunos autores sugirieron la contribución de las alteraciones cromosómicas como posible causa de la pérdida preimplantación de los embriones generados in vitro (3). Estas primeras observaciones se correlacionaron con la idea, entonces ya conocida, de que un elevado número de abortos tras la reproducción natural exhibían anomalías cromosómicas numéricas (aneuploidías) (4-6). Esto dio lugar a una serie de trabajos dirigidos al estudio de la ploidía de los embriones generados mediante FIV (3,7-9). Finalmente, un estudio multicéntrico pionero liderado por M. Plachot (10) mostró que efectivamente existía una elevada tasa de aneuploidía en los embriones preimplantación, correlacionado con factores iatrogénicos y etiológicos asociados a la infertilidad (edad materna, estimulación ovárica, procesos de laboratorio, etc), concluyendo que parecía existir una selección natural en contra de estos embriones. A principios de los años 90, los esfuerzos se centraron en intentar contrastar estas primeras observaciones. Los primeros grupos aplicaron la técnica de FISH (fluorescent in situ hybridization) en núcleos interfásicos de blastómeros obtenidos mediante biopsia embrionaria (11-15). La conclusión fue clara; no sólo se detectaba aneuploidía (monosomías y trisomías) sino también mosaicismo, poliploidía y haploidía. Además, estos embriones se desarrollaban “normalmente” in vitro, es decir, no existía una correlación con alteraciones morfológicas del embrión. Esto dio lugar a un concepto lógico y atractivo que generó cierto entusiasmo, el screening de aneuploidías (en inglés PGS: preimplantation genetic screening). Si podíamos seleccionar los embriones euploidies (con un número de cromosomas normales) para la transferencia, estos embriones tendrían un mayor potencial de desarrollo y, por tanto, mejor pronóstico para su implantación y consecución del embarazo.

Los primeros registros de la aplicación con éxito del PGS estudiaban los corpúsculos polares de los ovocitos (16, 17). Posteriormente, se trasladó al estudio del embrión en estadio de división, mediante el análisis de la biopsia de uno o dos blastómeros en el tercer día de cultivo. En la actualidad, las investigaciones se centran en el estudio genético de fragmentos de trofectodermo biopsiados de blastocistos, en el quinto día de cultivo in vitro.

EL DEBATE DEL PGS

Recientemente, ha habido un interesante y polémico debate acerca de la utilidad clínica del PGS. Desde los inicios, la aplicación del PGS se extendió por muchos laboratorios de FIV en todo el mundo, antes incluso de la publicación de estudios prospectivos aleatorizados que demostraran la validez del método. En el año 2010 la ESHRE (European Society of Human Reproduction and Embriology) publicó una declaración oficial (18) centrada, fundamentalmente, en aspectos metodológicos y basada en los primeros estudios aleatorizados (19). A pesar que la validez inferencial de alguno de los trabajos fue muy discutida (20), se concluyó que no existían evidencias suficientes acerca de los beneficios de la selección de embriones euploides para un número limitado de cromosomas mediante la técnica de FISH. Esta modalidad de PGS no mejoraba las tasas de embarazo por ciclo de FIV en casos de edad materna avanzada, fallos de implantación o pacientes de buen pronóstico. La conclusión fue que se imponía el diseño de estudios prospectivos aleatorizados mediante una técnica estandarizada que permitiera el estudio de la dotación cromosómica completa del embrión. Además, se reflexionaba acerca de las ventajas de estudiar la ploidía en otros momentos del desarrollo in vitro del embrión, dado el elevado grado de mosaicismo detectado en los embriones humanos en estadio de división.

En relación con la técnica de FISH, ésta ha permitido realizar el PGS durante más de una década. No obstante, ha resultado una aproximación técnica limitada por varios motivos: I) se realiza sobre núcleos en interfase fijados en portaobjetos. El proceso de fijación nuclear es muy delicado y dependiente de factores ambientales (temperatura y humedad del entorno), lo cual limita su reproducibilidad y requiere de un entrenamiento exhaustivo de las personas dedicadas a la extensión nuclear. II) La limitación del número y longitudes de onda de emisión de la fluorescencia (colores) de los fluorocromos disponibles, impide el análisis simultáneo de muchas sondas de hibridación, lo cual obliga a un proceso de hibridación secuencial que va degradando la calidad nuclear, comprometiendo el resultado del análisis tras varias rondas de hibridación. III) El estudio se limita a un número de cromosomas máximo (por lo expuesto en II), que puede oscilar entre 9 y 12 cromosomas. Estos cromosomas son los que están implicados fundamentalmente en abortos y nacidos vivos aneuploides, no obstante no son los únicos relevantes en estadios embrionarios tempranos. IV) El análisis se dirige a regiones cromosómicas concretas, aquellas con las que hibridan las sondas de ADN, excluyendo del análisis al resto de los cromosomas de la dotación completa. Por tanto, en sentido estricto, no es un análisis cromosómico directo sino el estudio de una región cromosómica (telomérica, centromérica o locus específica) de la que se infiere el número de copias de un cromosoma. V) Por último, a pesar de la especialización alcanzada en los últimos años, la interpretación del patrón de señales de hibridación entraña cierto grado de subjetividad a la hora de definir los solapamientos, intensidad e hibridaciones inespecíficas de las sondas en las extensiones nucleares.

ESTRATEGIAS MOLECULARES

Las limitaciones de la técnica de FISH pueden dar lugar a un análisis no exhaustivo de los embriones preimplantación y comprometer el éxito reproductivo. Por este motivo se han explorado nuevas estrategias diagnósticas encaminadas al estudio del complemento cromosómico completo (21). En los últimos años se ha propuesto una variedad de estudios moleculares, con mayor o menor éxito, dirigidos al análisis de todos los cromosomas autosómicos y cromosomas sexuales bajo la denominación de “estudios de 24 cromosomas”. Estos estudios incluyen la hibridación genómica comparativa en metafase (22, 23), la PCR (polymerase chain reaction) cuantitativa (24), los microchips (arrays) de ADN basados en polimorfismos SNP (single nucleotide polymorphims) (25, 26), la construcción de haplotipos basados en SNPs (Karyompaping) (21) y los microchips de hibridación genómica comparada (en inglés CGHa: Comparative Genomic Hybridization arrays) (27, 28). La técnica de CGHa se ha consolidado como la técnica más extendida. La principal ventaja es que resuelve los problemas que planteaba la FISH (poca cobertura por cromosoma y análisis cromosómico parcial) y, al mismo tiempo, no interroga en exceso el contenido genómico del embrión, de forma que no accedemos a la información genética profunda (la secuencia del ADN) que nos plantearía un problema a la hora de informar sobre los hallazgos de significado incierto.

LA TÉCNICA DE  CGHa

Los CGHa se utilizan de forma extensiva en otras áreas de la Genética, tanto a nivel prenatal como posnatal. Aspectos relativos a su aplicación en estos campos, límite de detección, indicaciones, etc, han sido ampliamente discutidos y recogidos en documentos de consenso internacionales (29,30). En general, el uso de los CGHa está orientado a la identificación de variaciones en el número de copia (en inglés CNV: copy number variations), es decir ganancias o pérdidas de regiones génicas de tamaño inferior al límite de detección del cariotipo, a lo largo de todo el cromosoma.

En el caso concreto de los CGHa utilizados en el PGS, la principal diferencia respecto a otras aplicaciones es que se requiere una preamplificación del genoma del blastómero o trofectodermo biopsiado, ya que contamos con una limitación importante; la mínima cantidad de ADN existente en la muestra original, unos 6 pg en una célula diploide. El método utilizado para esta primera amplificación del genoma embrionario no es trivial y se han propuesto varios sistemas (31). Una vez amplificado el ADN original (figura 1), el proceso completo continúa con un marcado del ADN amplificado y de un ADN de referencia con sendos fluorocromos que emiten a diferente longitud de onda tras ser excitados con una luz ultravioleta (verde o rojo). Este marcado, nos permitirá determinar dosis génicas a posteriori. Estos dos ADN marcados (muestra y referencia) se mezclan y se hibridan en una reacción competitiva sobre un soporte físico (microchip) en el que están inmovilizadas unas secuencias de ADN que representan el genoma completo. Ambas muestras de ADN compiten para unirse con su región homóloga de ADN impresa en el chip. Una vez terminada la hibridación, el soporte se somete a una luz ultravioleta que excita los fluoróforos y emiten una fluorescencia que es captada por un escáner. Un software adjudica un color del espectro visible a las longitudes de onda que se emiten (verde, roja o su mezcla; amarillo) de forma que nos permite identificar dosis de cada color, determinando así pérdidas o ganancias de ADN. Los sistemas de digitalización de imagen integran toda la información mediante un algoritmo bioinformático y el software nos muestra las imágenes de las muestras analizadas de forma individualizada y por cromosoma (figura 2). Esta aplicación rinde una gran cantidad de información a escala cromosómica, detectando pérdidas o ganancias de cromosomas enteros (aneuploidías), desequilibrios de alteraciones cromosómicas estructurales (27) e incluso pérdidas de fragmentos cromosómicos. En función del tipo de secuencias de ADN inmovilizadas en el soporte, se pueden distinguir varios tipos de microchips, según la finalidad del ensayo (32). En el caso de los chips utilizados en la gran mayoría de los laboratorios de DGP, las secuencias de ADN están clonadas en cromosomas artificiales bacterianos (BAC: Bacterial Artificial Chromosomes) que se inmovilizan en miles de puntos conocidos como spots. En en los CGHa de BACs, se estima que cerca de 3000 fragmentos de ADN humano están clonados en los BACs y pertenecen a loci distribuidos a intervalos de aproximadamente 1 Mb a lo largo de cada cromosoma. Esto permite el análisis exhaustivo de los cromosomas enteros y anomalías parciales de regiones génicas, con una resolución cercana a 10Mb. Además, también podemos utilizar chips con una mayor densidad de clones, para aplicaciones distintas al PGS, por ejemplo detección de duplicaciones y deleciones derivadas de reordenamientos cromosómicos estructurales.

Las principales ventajas de los CGHa son: I) se obtiene información de todos los cromosomas completos; II) se puede obtener ADN suficiente para estudios adicionales (33); III) se trata de un proceso automatizado y, por tanto, fácilmente reproducible; IV) se reduce mucho la subjetividad del analista a la hora de interpretar los resultados; V) el tiempo de procesado e informe de resultados está muy próximo a las 24 horas, con lo que es compatible con el cultivo y transferencia embrionaria en el mismo ciclo. No obstante, es muy importante conocer las limitaciones del CGHa; I) no es posible detectar poliploidías completas (p.e: 69, XXY) en las que no exista desequilibrio de dosis para algún cromosoma; II) no permite detectar reordenamientos cromosómicos equilibrados; III) en el caso de biopsia de trofectodermo no es posible identificar mosaicos de baja frecuencia y IV) el elevado coste del análisis. Resulta muy complejo establecer hasta qué punto estas limitaciones, en su conjunto, se pueden correlacionar con una tasa teórica de error de diagnóstico adverso (transferencia de un embrión aneuploide con diagnóstico de euploide), pero se estima que el posible error asociado a la no detección de una poliploidía o haplodía completas está en torno al 0,2 % (28).

RESULTADOS CLÍNICOS DEL PGS

Desde el punto de vista clínico, la primera aproximación del CGHa al campo del PGS fue publicada en 2002 (34). La aplicación en series de pacientes se publicó en 2010 (35, 36) y su validación clínica un año más tarde (28). En los últimos años, los esfuerzos se han centrado en el diseño de estudios prospectivos aleatorizados orientados a determinar la utilidad clínica del método. Es muy importante destacar que el análisis de la validez clínica del CGHa ha ido de la mano de un cambio en el momento en que se estudia el embrión. Actualmente, los estudios controlados y aleatorizados analizan la ploidía completa de los blastocistos, a partir de muestras de biopsia de trofectodermo (tabla 1). Este cambio se justifica por el menor grado de mosaicismo y aneuploidía del trofectodermo en comparación con el blastómero único (37), así como con el menor impacto de la biopsia en día 5 de cultivo in vitro (38). El primer estudio aleatorizado fue publicado en 2012 en pacientes de buen pronóstico (39), concluye que la transferencia de un solo blastocisto euploide revela un incremento significativo de la tasa de embarazo en curso (69 % vs 42 %; transferencia de blastocisto euploide vs blastocisto no estudiado). Posteriormente, el efecto de la edad materna fue estudiado por Schoolcraft y colaboradores (40) demostrando un significativo incremento en la tasa de embarazo en curso en mujeres mayores de 35 años (60,8 % vs 40,9 %; transferencia de blastocisto euploide vs blastocisto no estudiado). En 2013, Forman y colaboradores (41) demuestran que en mujeres ≤ 42 años de edad, la transferencia de un único blastocisto euploide resulta en la misma tasa de embarazo (sobre el 65 %) que la transferencia de dos blastocistos no analizados, eliminando la tasa de gestaciones múltiples. Esta misma observación la ratifican posteriormente en otro estudio en 2014 (42). Además, en otro estudio controlado y aleatorizado (38) el mismo grupo evidencia que la tasa de embarazo en curso después de transferir blastocistos euploides es significativamente superior al comparar con transferencias de blastocistos no estudiados (66,4 % vs 47,9 %). En el mismo sentido, recientemente se ha publicado un estudio caso/control prospectivo en pacientes con fallo recurrente de FIV (43) en el que se pone de manifiesto un incremento significativo en la tasa de embarazo en curso tras la transferencia de blasocistos euploides (68,3 % y 70,5 % vs 21,2 %; pacientes con fallo de implantación y controles frente a pacientes con fallo de implantación sin PGS). Respecto al efecto beneficioso en otros aspectos de la FIV, recientemente se ha publicado el efecto positivo del CGHa en los casos de factor masculino. En un estudio retrospectivo observacional se observa un incremento de la tasa de embarazo e implantación en parejas con FISH espermático patológico (44). El resultado de estos estudios orienta claramente hacia la aplicación de los análisis de 24 cromosomas como la forma más exhaustiva de valoración de la ploidía embrionaria. No obstante, el coste del procedimiento sigue siendo una de las limitaciones a la hora de aplicar el CGHa de forma universal a todos los pacientes de FIV como sistema de selección embrionaria basado en la ploidía.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Las estrategias diagnósticas en el campo de la Genética han experimentado una rápida evolución. El PGS no escapa a la revolución que está suponiendo la aplicación de las técnicas de ultrasecuenciación, también conocidas como secuenciación masiva o NGS (Next Generation Sequencing). Estas técnicas permiten acceder a la secuencia de nucleótidos completa de un genoma de forma masiva, simultánea y automática. Esta nueva perspectiva cambia por completo el paradigma de los estudios genéticos (45), ofreciendo una serie de ventajas que hacen irreversible su aplicación; I) el coste reducido del análisis, II) la alta precisión, III) la simultaneidad de los análisis (varios genomas al mismo tiempo), y IV) la combinación de análisis cuantitativos y cualitativos, con lo que potencialmente se pueden interrogar enfermedades monogénicas, alteraciones cromosómicas estructurales y aneuploidías simultáneamente. En el momento actual, varios grupos a escala mundial están validando técnicamente sus plataformas de NGS en el contexto del PGS (46-52). La revisión de los tipos de aproximaciones técnicas en el contexto de la NGS no es el objeto del presente trabajo, no obstante resulta muy interesante conocer las estrategias que ofrecen las distintas plataformas en ámbitos muy concretos como la secuenciación de novo de genomas completos, la secuencianción de regiones concretas de genomas conocidos con finalidad diagnóstica (resecuenciación dirigida), la secuenciación de transcriptomas completos, el estudio de perfiles de expresión y la metagenómica (53). Actualmente, no tenemos datos de la validación clínica de la NGS en PGS en series de pacientes. No obstante, el futuro próximo parece pasar necesariamente por este tipo de tecnologías.

COMENTARIOS FINALES

Desde el punto de vista clínico el PGS mediante la técnica de CGHa ofrece a las parejas de FIV una herramienta adicional en el contexto de lo que conocemos como eSET (elective Single Embryo Transfer), más allá de la selección morfológica. Los estudios aleatorizados demuestran que el análisis del complemento cromosómico completo permite elegir el embrión con un mejor potencial de implantación, alcanzar el embarazo en el mínimo número de ciclos posible y reducir al máximo las tasas de aborto o nacimiento aneuploide. Asimismo, los avances en otros aspectos de la reproducción asistida como la vitrificación, el cultivo prolongado, los estudios morfodinámicos o las nuevas estrategias de biopsia en otros momentos del desarrollo in vitro, van a cambiar muy probablemente el esquema tradicional del PGS. Los estudios genómicos masivos combinados con la vitrificación, acumulación de ovocitos o embriones y las transferencias en ciclos no estimulados, están insinuando nuevas estrategias en el modelo clásico; estimulación/FIV-ICSI/cultivo/transferencia. En este escenario en constante evolución, el papel del clínico resulta capital como prescriptor de servicios de diagnóstico altamente especializados. La interacción estrecha entre las unidades de reproducción humana asistida y genética se hace cada vez más necesaria (54). El conocimiento de las estrategias diagnósticas, los límites de detección de los ensayos, las indicaciones, el potencial de diagnóstico de las distintas plataformas de análisis, etc, resultan aspectos clave a la hora de solicitar un análisis genético. Asimismo, no hay que olvidar que la prescripción de un estudio genético requiere, en todos los casos, un adecuado asesoramiento genético (55) que permita al paciente conocer los alcances exactos de los estudios a los que se van a someter.