Estudio para la valoración diagnóstica del índice de fragmentación del ADN espermático en una población de pacientes del servicio de esterilidad

INTRODUCCIÓN

La esterilidad afecta a casi un 20% de las parejas en edad reproductiva y no en todos los casos la etiología se puede determinar. Aproximadamente en la mitad de los casos está involucrado el factor masculino y su evaluación requiere esencialmente el análisis del semen. El seminograma nos informa del estado clínico del sistema reproductivo del varón, pero no aporta una información completa sobre el potencial fecundante del semen, ya que se observa que un 10-15% de los varones estériles presentan un seminograma considerado normal (1, 2, 3).

El análisis del Índice de Fragmentación del ADN espermático (IF) puede suponer una aportación adicional en el estudio del semen del paciente, considerando que la transferencia del ADN íntegro desde el espermatozoide al óvulo puede ser esencial para conseguir una fecundación con ciertas perspectivas de éxito (2, 3).

La aparición de equipos comerciales para la preparación de las muestras, como Halosperm® (Halotech D, Madrid), y la utilización de analizadores automatizados tipo Computer Assister Semen Assay® (CASA), equipados con módulo específico de estudio de la fragmentación de ADN, ha posibilitado la determinación del test IF con una mínima fiabilidad metodológica y reproducibilidad (4), que no eran posibles hasta ahora con los métodos manuales.

El objetivo de este estudio ha sido la determinación del IF en una serie de varones fértiles, para validar y establecer el intervalo de referencia de la técnica y la realización del IF en un grupo de pacientes de probada esterilidad, a los que se había realizado también un seminograma y determinar la utilidad clínica de este nuevo parámetro en el diagnóstico de la subfertilidad del varón.

MATERIAL Y MÉTODOS

Pacientes

Se han estudiado 60 muestras de varones provenientes de la Unidad de Esterilidad de nuestro hospital, que presentaron una media de edad 36 años con un rango entre 29-44 años. De estos, 18 eran varones fértiles, y 42 eran pacientes de probada esterilidad, que presentaron como mínimo una de las siguientes indicaciones clínicas: tres fallos en la Inseminación Artificial con semen del Cónyuge (IAC), abortos recurrentes, mala calidad embrionaria, esterilidad idiopática de la pareja, o patologías androgénicas como varicocele o criptoquidia.

Seminograma

La recogida de semen se ha realizado siguiendo la normativa de la OMS y de la ESHRE (5, 6). El análisis de la concentración y movilidad espermáticas se han efectuado mediante el analizador Sperm Class Analyzer, un equipo automatizado de análisis de Semen tipo CASA. El análisis de la vitalidad se ha realizado siguiendo el método recomendado por la OMS, con la tinción eosina-nigrosina al 10% (5). Finalmente, se ha realizado el estudio de la morfología espermática siguiendo los criterios de Kruger (6, 7) y empleando el método rápido de tinción Diff-Quick® (Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, IL USA), con un contaje manual de un mínimo de 200 espermatozoides.

Los valores de referencia que hemos seguido son los establecidos por la OMS para la concentración (>40 millones espermatozoides/eyaculado), la movilidad (a+b OMS>50%) y la vitalidad espermática (>50% vitales), y para la morfología espermática hemos escogido el criterio de Kruger (>15% espermatozoides normales) (4).

Índice de Fragmentación del ADN espermático (IF)

Se ha realizado el IF mediante la técnica Sperm Chromatin Dispersión (SCD), con un equipo comercial Halosperm® (Halotech D, Madrid) para la preparación de las muestras, efectuando las lecturas con un analizador automático de sémenes SCA tipo CASA equipado con módulo específico de análisis de fragmentación (Microptic). Se visualizan un mínimo de 500 espermatozoides para la determinación del IF. En la Fig. 1 puede observarse la imagen de un campo de una muestra, preparada para efectuar la lectura automatizada de la diferenciación de la fragmentación espermática (espermatozoides con el ADN fragmentado y espermatozoides con el ADN intacto)

Métodos estadísticos

La curva ROC es el test estadístico más útil para valorar la eficiencia diagnóstica de un método analítico, y el posterior cálculo de su AUC (área bajo la curva) nos permite cuantificar su valor diagnóstico y compararlo con el de otros métodos analíticos, siendo el que presenta una mayor AUC, el de mejor valor diagnóstico (8, 9, 10, 11). Para determinar además si existen diferencias significativas entre las diversas AUC halladas, se aplica el test no paramétrico de Wilconxon.

El cálculo de los parámetros estadísticos se ha efectuado con ayuda de los programas estadísticos SPSS (SPSS, Chicago, IL USA) y MedCalc (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium).

RESULTADOS

A partir de las muestras de 18 varones fértiles hemos establecido nuestro propio intervalo de referencia para el IF. Éste presentó una media de 15% con un intervalo de confianza (IC) del 95% entre 9-21%. En consecuencia hemos interpretado como patológicos los IF superiores a 21%. El coeficiente de variación intradía (CV) de la técnica se calculó procesando 10 veces una muestra con un valor medio de 19%, y resultó del 8%.

Se ha estudiado una muestra de 60 varones, de los cuales 18 eran varones fértiles y 42 pacientes eran varones de probada esterilidad. Se observa que el nuevo parámetro IF ha presentado una sensibilidad del 54.8% y una especificidad de 66.7%, con una eficiencia diagnóstica del 58.33% en el diagnóstico de la subfertilidad del varón. El seminograma ha presentado una sensibilidad del 85.7% y una especificidad del 50%, con una eficiencia diagnóstica del 78.9%.

A partir de los resultados anteriores se construyen las curvas ROC (Receiver-Operating Characteristic) del IF y del seminograma completo, tal y como se muestra en la Fig. 2. Seguidamente se calculan las AUC correspondientes con su IC del 95%, que se muestran en la Tabla 1. Los resultados indican que el seminograma presenta una AUC=0.679, frente a un AUC=0.607 del IF. Según Swet (10), al tener el seminograma una mayor AUC que el IF, es el parámetro que presenta un mayor valor diagnóstico de la subfertilidad del varón. La suma de ambos parámetros para el diagnóstico dibuja una curva con un AUC=0.595.

Si se observan los resultados de las curvas ROC y sus correspondientes AUC de los parámetros del seminograma, que se muestran en la Fig. 3 y en la Tabla 1, se deduce que la morfología espermática, con una AUC=0.659, es el parámetro que presenta una mayor valor diagnóstico del seminograma (11, 12). se aplica el test de Wilcoxon para saber si entre las AUC halladas existen diferencias estadísticamente significativas, y en ningún caso se observa una p<0,05.

CONCLUSIONES

Desde hace ya algún tiempo nuestra unidad ofrece la posibilidad de la determinación de manera rutinaria de IF. La llevamos a cabo mediante la técnica Sperm Chromatin Dispersión (SCD) con un equipo comercial Halosperm® (Halotech D, Madrid) para la preparación de las muestras y con el empleo de un analizador automático de sémenes Sperm Class Analyzer® (SCA) tipo Computer Assister Semen Assay® (CASA) para las lecturas.

Con el presente estudio hemos querido comprobar la utilidad clínica de la determinación del Índice de Fragmentación del ADN espermático (IF) como herramienta diagnóstica de la subfertilidad en una muestra de 60 pacientes del servicio de Esterilidad.

A partir de una población de 18 pacientes fértiles hemos establecido el intervalo de referencia para la nueva determinación del IF, que presentó una media del 15% con un IC del 95% entre 9-21% y el coeficiente de variación de la técnica resultó del 8%. El valor normal es similar a los que actualmente se encuentran publicados en la bibliografía (12) y el CV en una muestra con un valor cercano al discriminante, ha resultado adecuado para garantizar unos resultados reproducibles.

Los primeros datos obtenidos son los de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad del seminograma es substancialmente mayor a la del IF y su valor es similar al que encontramos en numerosas publicaciones (2, 3, 11). Sin embargo el IF presenta una especificidad mejor. Se podría pensar que los resultados eran previsibles, aunque se esperaría una especificidad todavía más alta para el IF, sobretodo en un grupo de pacientes de estas características.

Los resultados de las AUC de las curvas ROC del seminograma, tanto en su conjunto como de sus parámetros por separado, y del IF nos muestran que ninguna prueba es claramente destacable sobre el resto, puesto que en ningún caso se aprecian diferencias significativas, según el test de Wilcoxon. Tampoco mejora el valor del AUC al diagnosticar con los resultados del seminograma y del IF conjuntamente. De todas maneras sería el seminograma el que al presentar una mayor AUC ofrecería un mayor valor diagnóstico para la subfertilidad del varón, y dentro de los parámetros de éste, sería la morfología espermática la más determinante, por la misma razón.

A partir de los datos puede leer que el seminograma es hasta el momento el mejor método de cribado y que no mejora al añadir a su batería el IF. Éste estaría pensado para un uso en un segundo nivel debido a su mejor especificidad, y de hecho a lo largo de este estudio hemos observado que un valor patológico en el Índice de Fragmentación del ADN espermático bien explicado ha sido un buen argumento para ayudar a decidirse a aquellas parejas que todavía presentaban dudas para acogerse a la inseminación artificial de donante (IAD) o acceder a otras técnicas de reproducción asistida de complejidad superior. Sigue pareciendo coherente pensar que la transferencia de un ADN íntegro desde el espermatozoide al óvulo puede ser esencial para conseguir una fecundación con ciertas perspectivas de éxito, y que IF patológicos pueden disminuir significativamente las ya pobres probabilidades de consecución de la inseminación artificial.