Evaluación de la actividad antioxidante de suplementos dietéticos utilizados para mejorar la fertilidad masculina

INTRODUCCIÓN

La infertilidad masculina es un problema multifactorial sin causa identificable en un porcentaje significativo de casos, con un tratamiento complejo. Las alteraciones en la concentración de espermatozoides, así como su movilidad y morfología contribuyen a la patogenia de la infertilidad. En la última década se han identificado diversos factores como la contaminación ambiental o el estilo de vida con impacto negativo sobre la espermatogénesis, y por tanto, con gran repercusión sobre la infertilidad masculina, por su influencia sobre la calidad seminal (1-2).

El estrés oxidativo ha sido identificado como un factor destacado que contribuye a la reducción de la fertilidad masculina, demostrándose que, concentraciones elevadas de radicales libres de oxígeno, inducen procesos de peroxidación en las membranas de los espermatozoides, afectando a parámetros como la movilidad y morfología (3-5). La infertilidad se ha relacionado con un desequilibrio entre la generación de radicales libres de oxígeno y los sistemas antioxidantes naturales. Las recomendaciones habituales para contrarrestar los efectos negativos del estrés oxidativo incluyen la ingesta de antioxidantes.

Diversos estudios clínicos han evaluado los efectos del tratamiento con suplementos antioxidantes por vía oral sobre la calidad espermática en el varón, así como en los procesos de fertilización in vitro y tasas de embarazo obtenidas (6-8). A pesar de que no existe uniformidad en cuanto al diseño de estos ensayos clínicos ni en los suplementos utilizados, que permitan comparar los resultados obtenidos para poder establecer la suplementación óptima en la dieta, las revisiones más recientemente publicadas permiten concluir acerca de resultados positivos sobre el porcentaje de embarazos o de recién nacidos tras la ingesta de suplementos antioxidantes (4, 9-11). Estos estudios han confirmado el efecto beneficioso demostrado por los antioxidantes en trabajos previos en los que se analizaba su efecto sobre la calidad seminal. El uso de suplementos dietéticos se ha extendido en los tratamientos de fertilidad masculina en la reproducción asistida a pesar de la necesidad emergente de realizar estudios clínicos controlados y randomizados que puedan poner de manifiesto la eficacia clínica de estos suplementos antioxidantes sobre la fertilidad masculina.  

En la actualidad, existen comercializados distintos suplementos alimenticios utilizados en Andrología que contienen en su composición agentes antioxidantes reconocidos, principalmente vitaminas y minerales. El objetivo del presente trabajo ha sido la evaluación comparativa de la actividad antioxidante de cinco suplementos alimenticios comerciales: AndroMÁS®, Androferti®, Aquilea Fértil®, GestaDha®, Seidiferty®.

MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación de las muestras

La disolución de las muestras de los suplementos se llevó a cabo utilizando metanol o etanol en función de su solubilidad, disolventes aceptados en la literatura para estos ensayos (12). Se prepararon diluciones seriadas de cada suplemento a partir de una solución stock (1 mg/ml), inmediatamente antes de la realización de los ensayos. Se ensayaron dos lotes de cada suplemento.

 

Determinación de la actividad antioxidante

Ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)

El ensayo ORAC se llevó a cabo siguiendo la técnica descrita por Davalos et al. (13). Las muestras de los distintos suplementos (rango concentración final 0,005-0,00002 mg) y el Trolox (1-8 µM), compuesto antioxidante de referencia, se incubaron durante 10 minutos a 37º C con fluoresceína (concentración final 70 nM) en un un fluorímetro FLUOstar Optima (BMG Labtech, Offenburg, Germany). La reacción se inició por la adición de [2,2’’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, AAPH] (concentración final 12 mM) en un volumen final de 200 µL. Se midió la cinética de fluorescencia cada 56 s durante 98-120 min [excitación: 490 nm, emisión: 520 nm]. Se calcularon los valores del área bajo la curva (AUC) para cada suplemento, comparándose con los AUC correspondientes al Trolox. Los resultados obtenidos se expresaron como µmoles de Trolox/mg de muestra.

 

Ensayo de actividad captadora del radical diphenilpicryl-hidrazyl  (DPPH)

Para la determinación de la actividad captadora de radical DPPH se siguió el método descrito por Molyneux (14). Se prepararon diluciones de la muestra a partir de una solución stock de 1 mg/ml  (concentración final rango 0,5-0,083 mg) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con DPPH (concentración final 60 µM). Al final del periodo de incubación se determinó la disminución de la absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro de placa Digiscan. La absorbancia de la solución de DPPH pura incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos se consideró como el control, calculándose la actividad captadora del radical de cada muestra, tras la incubación de las muestras objeto de estudio con DPPH. Los resultados se expresan en porcentaje de inhibición de la generación de radical DPPH respecto a la reacción control (100 % de generación de radical en ausencia de suplemento).

 

Análisis estadístico

Los resultados obtenidos se expresan como la media ± error estándar medio (E.S.M.) de los datos obtenidos de dos lotes de cada uno de los preparados estudiados (n = 5 por lote). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido del test de Newman-Keuls de comparación múltiple. Se consideraron significativos valores de p<0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SigmaPlot 11.0.

 

RESULTADOS

El análisis de las curvas de decaimiento de la fluorescencia en el ensayo ORAC con los cinco suplementos ensayados (AndroMÁS®, Androferti®, Aquilea Fértil®, GestaDha®, Seidiferty®), reveló que el preparado Aquilea Fértil no mostraba un comportamiento normal como compuesto antioxidante, por lo que no pudo ser evaluado comparativamente en el estudio. El efecto antioxidante de los preparados se calculó mediante las diferencias de áreas bajo la curva de decaimiento de la fluoresceína entre el blanco y la muestra, comparándose frente a la curva de Trolox (Fig. 1A).  De los otros cuatro suplementos testados, AndroMÁS y Seidiferty presentaron la mayor actividad antioxidante (Fig. 1B). 

A partir de la relación entre las pendientes de las curvas descritas en la Fig. 2 con la pendiente de la curva relación área bajo la curva de decaimiento versus concentración de Trolox, se calcularon los índices ORAC para cada uno de los suplementos testados, como se indica en la Fig. 2. Los índices ORAC comparativos de los distintos preparados, permitieron establecer el siguiente orden de actividad de los preparados AndroMÁS ≈ Seidiferty > Androferti > GestaDha presentando AndroMás y Seidiferty diferencias estadísticamente significativas respecto a los demás suplementos ensayados (p<0,05). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los índices ORAC de los dos lotes ensayados de cada suplemento, ni entre los valores ORAC de los dos suplementos más activos AndroMÁS® y Seidiferty®.

El ensayo de actividad captadora de radical DPPH mostró, como se aprecia en la Tabla 1, que la incubación de las muestras de los suplementos  AndroMÁS, Androferti y Seidiferty con DPPH en tampón fosfato a 37º C, producía una disminución de la absorbancia a 515 nm. Estos resultados indicaban que los suplementos AndroMÁS, Androferti y Seidiferty mostraban actividad antioxidante significativa frente a la reacción control (p<0,05), siendo ésta dependiente de la concentración en el caso de AndroMÁS y Androferti. En este ensayo el orden de actividad mostrado fue el siguiente: AndroMÁS > Androferti > Seidiferty, con valores de Concentración Inhibitoria 50 (CI50) de 0,170, 0,223 y 0,434 mg/ml, respectivamente. GestaDha no presentó actividad captadora de este radical, mientras que el suplemento Aquilea Fértil no pudo ser ensayado por interferencia con el ensayo. Como era de esperar, el Trolox, utilizado como compuesto antioxidante de referencia, mostró un valor IC50 de 1,6 µM.

DISCUSIÓN

El presente estudio ha evaluado la actividad antioxidante de distintos suplementos comerciales utilizados en Andrología para mejorar la calidad espermática. Aunque se ha descrito la actividad antioxidante de distintos componentes presentes en estos suplementos, como es el caso de la vitamina C, E y vitaminas del grupo B, no existen estudios previos en la literatura en los que se haya evaluado la actividad antioxidante de este tipo de suplementos dietéticos comerciales.

En el estudio se han utilizado dos métodos ampliamente validados en la literatura para la determinación de la actividad antioxidante de suplementos dietéticos. Dado que no se ha descrito la existencia de un único ensayo de actividad antioxidante estandarizado, se eligió un método basado en la transferencia de electrones (ORAC) y otro método basado en la transferencia de un átomo de hidrógeno (DPPH), de acuerdo con las recomendaciones del IUPAC Technical Report (15). Los resultados obtenidos en el ensayo ORAC de generación de radicales peroxilo, que simula las reacciones de antioxidantes con lípidos en sistemas fisiológicos y es aplicable a la evaluación tanto de antioxidantes hidrófilos como hidrófobos, ponen de manifiesto que AndroMÁS y Seidiferty presentan la mayor actividad antioxidante en base a los valores ORAC obtenidos, que se encuentran dentro del rango establecido para suplementos dietéticos en la literatura (0,018-3,18 μmol Trolox/mg de suplemento). Adicionalmente, el suplemento AndroMÁS también mostró mayor actividad  antioxidante en el ensayo de captación del radical DPPH, seguido por Androferti y Seidiferty. Aunque no se han observado diferencias significativas entre estos dos preparados, se confirma la actividad antioxidante de los mismos.

Diversos estudios sugieren que la ingesta de suplementos antioxidantes se asocia con efectos beneficiosos sobre la fertilidad masculina, ya que contribuiría a contrarrestar los efectos dañinos que ejerce el estrés oxidativo sobre la calidad del semen (11, 16). Este estudio ha puesto de manifiesto la actividad antioxidante de los suplementos  AndroMÁS y Seidiferty, propiedades que podrían contribuir a la eficacia terapéutica de sobre la infertilidad masculina.