INTRODUCCIÓN
Durante los últimos años, las técnicas de reproducción asistida han sufrido un incremento importante en países desarrollados, como es el caso de España (1, 2). Este hecho es debido a múltiples factores entre los que destacan el deterioro en la calidad del semen y el retraso en la edad de la mujer para tener hijos.
Como consecuencia de este aumento en el número de tratamientos realizados, la tasa de gestaciones múltiples también se ha visto incrementada, ya que se tiende a aumentar el número de embriones a transferir con el fin de conseguir mejores tasas de implantación y embarazo (3).
Las complicaciones que se derivan de un embarazo múltiple suponen una situación de riesgo tanto para la madre como para el feto, entre las que destacan el parto prematuro, la mortalidad perinatal y el bajo peso al nacimiento entre otras (4). Es por ello que muchos países u organizaciones científicas han decidido regular mediante leyes o recomendaciones el número de embriones máximo que se puede transferir al útero materno (5).
Actualmente la selección de embriones para transferencia se basa en criterios morfológicos detallados (6). Sin embargo, esta metodología posee una serie de limitaciones debido tanto a su subjetividad, como al hecho de presentar una gran variabilidad inter e intraobservador.
Por otra parte, es conocida la capacidad del embrión humano para consumir y secretar diferentes proteínas y/o metabolitos al medio de cultivo, con el fin de iniciar la comunicación con el endometrio materno necesaria para el proceso de implantación (7). Por esta razón, la tendencia actual es poder identificar el mayor número posible de marcadores no invasivos de viabilidad embrionaria, que, mediante un análisis rápido, y siempre acompañado de la morfología clásica, permita la transferencia de un único embrión con el mayor potencial de implantación.
Algunas de las moléculas sugeridas como candidatas a marcadores de viabilidad embrionaria son el factor estimulador de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF), el antígeno leucocitario humano G (HLA-G), el factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina (HB-EGF) y la ubiquitina. El GM-CSF es una citoquina secretada por el tracto femenino y está implicada en el crecimiento y desarrollo embrionario preimplantacional en varias especies (8). El HLA-G es una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad que se expresa de forma selectiva en células del citotrofoblasto velloso desarrollando un papel importante en la inmunoprotección del embrión (9). La Hb-EGF es una proteína de la que se ha demostrado su implicación en el desarrollo hasta blastocisto así como en la receptividad endometrial (10). Por último, la ubiquitina es una proteína implicada en la gametogénesis y en la modificación endometrial al principio de la gestación (11).
El objetivo de este estudio fue detectar estas moléculas en el medio de cultivo embrionario y comprobar, por una parte, su relación con la implantación, y por otra, si existía relación entre su secreción al medio de cultivo y el tipo de gonadotropina utilizada en la estimulación ovárica de las pacientes.
MATERIAL Y MÉTODOS
El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital General de Valencia. Para identificar si las moléculas mencionadas anteriormente estaban implicadas en el proceso implantatorio se analizó el medio en el que habían sido cultivados los embriones hasta el momento de su transferencia en día 2 de desarrollo.
Obtención de la muestra
En el estudio se incluyeron 51 mujeres que acudieron al Hospital General de Valencia con el fin de realizarse un tratamiento de fecundación in vitro. Se descartaron aquellas pacientes mayores de 38 años, así como parejas con ciclos de biopsia testicular.
La estimulación ovárica de las pacientes se realizó mediante protocolo corto con hormona foliculoestimulante (FSH) altamente purificada (Fostipur 225UI/día) en 18 de las pacientes, y FSH recombinante (225 UI/día) en las 33 restantes. Para el frenado hipofisario se administraron antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) cuando el tamaño de los folículos alcanzaba los 15mm.
Los ovocitos fueron recogidos mediante punción-aspiración folicular entre 36 y 38 horas después de la administración de gonadotropina coriónica humana (hCG). Posteriormente fueron decumulados y microinyectados siguiendo el protocolo habitual del laboratorio. Entre 17 y 19 horas después, se evaluó la fecundación y los ovocitos fecundados fueron cultivados en medio G1.5 (Vitrolife®) durante 20 horas.
La transferencia embrionaria se realizó en día 2 de cultivo siguiendo criterios morfológicos. Posteriormente, se recogieron los medios de cultivo donde se habían desarrollado los embriones y se congelaron a -80ºC hasta su posterior análisis.
Análisis de las muestras
El medio de cultivo obtenido de los embriones incluidos en el estudio se analizó mediante dos metodologías distintas. Por un lado, el GM-CSF se detectó mediante Luminex (citómetro de flujo modificado con anticuerpos fluorescentes).
A su vez, la ubiquitina, HLA-G y Hb-EGF se analizaron mediante Zeptosens (plataforma de microarrays de proteínas). Esta técnica permite analizar diversas proteínas en un gran número de muestras simultáneamente, basándose en la captura de las mismas y posterior marcaje sobre una platina de cuarzo.
Todos los datos de cada embrión se recogieron de forma individual, al igual que los datos obtenidos de cada medio de cultivo, para su posterior análisis estadístico por chi-cuadrado y T-student con SPSS 15.0.
RESULTADOS
En este estudio se analizaron un total de 87 muestras donde se habían cultivado los embriones hasta el momento de su transferencia. Para poder determinar la capacidad de implantación de cada embrión, únicamente se tuvieron en cuenta las muestras que generaron un 100% de implantación o un 0%, excluyéndose el resto.
La gestación se evaluó realizando una medición cuantitativa de la hormona hCG en sangre 15 días después de la fecundación del ovocito. Cuando el valor de esta medida fue superior a 5 mUI/ml, y pasados 15 días se visualizó la presencia de saco embrionario, se consideró esta muestra como positiva. Cuando este valor fue menor de 5mUI/ml se consideró como negativa. De este modo, del total de 87 embriones sólo se tuvieron en cuenta 47 embriones que no implantaron y 8 que implantaron.
Las moléculas estudiadas se detectaron en todos los medios de cultivo analizados. No se hallaron diferencias significativas en los valores de estas moléculas entre los embriones que no implantaron y los que sí. Ubiquitina 4.58 vs 4.73 Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (UAF); Hb-EGF 7.70 vs 6.77 UAF; HLA-G 1.10 vs 0,71 UAF; GM-CSF 7.72 vs 9.13 pg/µl.
Se hallaron diferencias significativas en el nivel de Hb-EGF y el tipo de gonadotropina empleada humana vs recombinante (6.33 vs 7.77 UAF).
Todos los resultados del estudio están recogidos en las tablas 1 y 2, y en las figuras 1 y 2.
DISCUSIÓN
El análisis de las moléculas propuestas como posibles marcadores de viabilidad embrionaria ha demostrado que ya en estadíos tempranos del desarrollo, el embrión segrega al medio de cultivo moléculas relacionadas con el proceso implantatorio. Todavía se desconoce el mecanismo exacto por el que el embrión puede metabolizar cada una de estas moléculas, así como el papel concreto que desempeñan en el proceso de implantación.
Existen estudios previos que demuestran la implicación de estas moléculas en el diálogo embrión-endometrio. La GM-CSF y sus receptores fueron localizados mediante western-blot y técnicas inmunohistoquímicas en el ovario (12, 13), mostrándose una detección diferencial entre los folículos grandes y los atrésicos que apenas expresaban estas moléculas. Otros autores demostraron que la adición de esta citoquina al medio de cultivo incrementa la proporción de embriones que se desarrollan hasta estadío de blastocisto (8), así como su papel en la prevención de la apoptosis de la masa celular interna (14). Estas evidencias indican que el GM-CSF es una proteína importante en el metabolismo del blastocisto y que podría, por tanto, ser considerado un biomarcador de viabilidad embrionaria.
La HLA-G desarrolla un papel esencial en la inmunoprotección del embrión, protegiendo al feto de ser rechazado por la madre. Algunos estudios detectaron mayor proporción de esta molécula y de su mARN en aquellas pacientes que conseguían mantener su embarazo sin sufrir una pérdida fetal (15, 16). Otros artículos relacionan su concentración en el medio de cultivo, pasado el día 3 de desarrollo, con una mayor tasa de implantación y embarazo (9, 17). Sin embargo, los datos no son absolutos debido a los embriones HLA-G negativos que daban lugar a embarazos.
El análisis del secretoma de blastocistos humanos reveló diferencias significativas en la expresión de ubiquitina (18). Los embriones que se desarrollaban correctamente mostraban una fuerte expresión de esta proteína, mientras que los degenerados carecían de ella.
El HB-EGF parece estar relacionado con la receptividad endometrial. Es sintetizado como un precursor transmembrana (tm-HB-EGF) que posteriormente es procesado proteolíticamente para formar su forma soluble (sol-HB-EGF). Un estudio mostró que el tm-HB-EGF se localizaba en la cara apical del epitelio luminal del endometrio en el momento de la implantación. Así como su receptor se expresaba en el trofoctodermo de blastocistos humanos, mostrando una evidente implicación en el proceso de implantación (10).
En nuestro estudio no hemos encontrado diferencias significativas en la secreción de estas moléculas. A pesar de ello, se observa una secreción diferencial por parte de los embriones que implantan. De este modo, para poder crear un modelo predictivo robusto sería necesario ampliar el número de muestras, así como analizar el perfil proteico en estadíos más avanzados del desarrollo del embrión como pudiera ser día 3 o 5 de cultivo. Tal vez en este caso, al encontrarse el embrión en estadíos más próximos a la ventana de implantación, las diferencias en la secreción de moléculas sean más marcadas.
Respecto al tipo de gonadotropina utilizada en la estimulación de las pacientes, parece no afectar a la secreción de moléculas por parte del embrión. Sólo se han encontrado diferencias con el HB-EGF, mostrando mayor concentración cuando la estimulación se realizaba con gonadotropina recombinante. Estas diferencias, no parecen tener implicación fisiológica, ya que no se traducen en diferencias estadísticamente significativas en cuanto a implantación embrionaria. La posible explicación es que en el análisis, se esté detectando la forma precursora de la molécula (18, 19)
En resumen, el estudio del perfil proteico de los medios de cultivo embrionario a lo largo del desarrollo preimplantacional, puede ayudar a discriminar los embriones con mayor potencial implantatorio dentro de una misma cohorte, con la finalidad de realizar transferencias selectivas de embriones, previniendo así los embarazos múltiples.