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embriología

Polaridad y totipotencia durante el desarrollo preimplantatorio

Durante mucho tiempo se ha intentado hallar las primeras diferencias entre células que ocurren durante el desarrollo preimplantacional en el embrión de mamífero, y que posteriormente darán lugar a diferentes destinos celulares. En los últimos años los estudios han demostrado que este proceso está regulado por diferencias en interacciones célula-célula, expresión génica y el microambiente de cada célula, en vez de por la división diferencial de determinantes maternos como pasa en otras especies. Sin embargo como aparecen estas diferencias en un primer momento y como regulan los factores moleculares y celulares implicados en la diferenciación celular es una pregunta por resolver. La escasez de material y las limitaciones éticas complican el estudio en embriones humanos. Poco a poco los nuevos avances en técnicas de imagen y análisis de transcriptómica de una única célula proveen nuevos conocimientos que ayudarán a resolver las dudas que se plantean hoy en día. 

For a long time, it has been tried to find the first differences between cells taking place during preimplantational development of the mammalian embryo, arising different cell fates. Instead of differential divisions of maternal determinants as occurs in other species. It has been shown that this process is regulated by differences in cell to cell interactions, gene expression and individual cell microenvironment. However, how this differences at first appear and how molecular and cellular factors involved in differentiation are regulated, is still unknown. Material shortage and ethical limitations complicate the study on human embryos. Gradually the new advances in imaging techniques and transcriptome analysis of a single cell provide new insights that will help to solve questions that arise today.
Autores:
Blanca Corral Castroviejo
Blanca Corral Castroviejo1, Roberto Matorras Weinig2,3 1Máster en Biotecnología de la Reproducción Humana Asistida. Universidad de Valencia. Facultad de Medicina, 2Hospital de Cruces. Universidad del País Vasco. 3IVI Bilbao.


INTRODUCCIÓN

La regulación de la totipotencia celular y el comienzo de la diferenciación celular son de gran importancia para el crecimiento embrionario temprano. La totipotencia está definida como la capacidad de una célula de mantener el crecimiento de todos los tejidos del feto, incluyendo la línea germinal.

Durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, las células o blastómeros que integran los embriones son totipotentes. La principal razón para considerar únicos a los embriones de mamífero es la plasticidad de que disponen durante el desarrollo, particularmente en los estadios preimplantatorios. Gracias a ella son capaces de reponerse a perturbaciones experimentales que puedan interrumpir el patrón temprano en formación.

Se considera que los blastómeros en estadio de 8 células aun retiene esa totipotencia y poseen la habilidad de generar los tres linajes el epiblasto (EPI) y el endodermo primitivo (PE) procedentes de la diferenciación de la masa celular interna (MCI) y el trofoectodermo (TE). En ensayos de desagregación o aislamiento de cada una de los blastómeros que integran el embrión de mamífero, se ha visto que las células embrionarias mantienen su memoria celular, no alterándose con ello el programa de desarrollo en curso. Así, transcurridas 5-8 divisiones mitóticas, y según el programa de desarrollo embrionario pre-establecido, los embriones deben iniciar el programa de diferenciación celular en los linajes propios del blastocisto. La diferenciación de los linajes (TE y MCI) es completa siempre y cuando se alcance un número mínimo umbral de células que integren el embrión. A mediados del siglo XX, mediante esta tecnología se obtuvieron embriones completos a partir de blastómeros aislados de embriones en estadio de 2 células de rata, entre otras especies (1). Y posteriormente, mediante agregación de uno o dos blastómeros que se encuentren en los estadios de 4 y 8 células en embriones receptores genéticamente, se demostró que mantienen la capacidad de contribuir a diferentes tipos celulares a partir de esas quimeras (2). En estos estudios se asume que tanto el óvulo como el embrión durante las primeras divisiones embrionarias, no poseen ningún signo de polaridad conociéndose este mecanismo de desarrollo como regulativo.

Por el contrario en  la mayoría de los invertebrados, los primeros síntomas de polaridad y por lo tanto el establecimiento de los ejes embrionarios ocurre antes de la fecundación. La polaridad en el embrión temprano, es decir, las diferencias entre polos opuestos del embrión, es crucial para su desarrollo porque determina la estructura corporal del organismo completo. Las moléculas de las células en división se distribuyen de forma asimétrica entre polos opuestos del ovocito actuando como determinantes que marcan diferentes destinos celulares dependiendo del citoplasma que hereden durante las divisiones celulares, como se ha visto en Drosophila (3) entre otros. Este mecanismo de desarrollo podemos denominarlo mosaicismo y significa que desde el comienzo de la segmentación las células están predestinadas y no son por tanto equivalentes.

Aunque en muchas especies la polaridad del embrión tiene sus raíces en el patrón espacial del ovocito, por mucho tiempo se ha creído que los mamíferos son una excepción de este modelo  porque la capacidad reguladora y el patrón temprano se consideraban en general propiedades exclusivas. La visión más aceptada del desarrollo embrionario inicial de los mamíferos es que las células que se originan son equivalentes y que por lo tanto no hay diferencias entre unas zonas y otras del embrión antes de la implantación. En los estudios clásicos se describía a las células del embrión temprano como completamente primitivas en las que el destino está marcado por interacciones entre ellas mismas. Además, explican como la polaridad embrionaria se establece únicamente durante o un poco antes de la gastrulación, posiblemente debido a las interacciones entre el embrión y el útero de la madre tras la implantación (4).

Sin embargo,  posteriormente surgieron una serie de estudios cuyo objetivo era determinar si todas los blastómeros de los estadios más tempranos son equivalentes y si existe una conexión entre la polaridad del ovocito y la del blastocisto con el objetivo de determinar si la progenie de alguno de los blastómeros ocupan una posición específica preferentemente en el blastocisto (5). Estos estudios defienden que  patrón y regulación temprana no son excluyentes uno del otro y podría darse la polaridad embrionaria de una manera menos determinante  dotando al embrión de flexibilidad durante esas primeras divisiones del desarrollo.  

A pesar de que con el tiempo ha habido un creciente número de evidencias que ponen de manifiesto los sistemas que regulan la embriogénesis en mamíferos la controversia no se ha resuelto completamente todavía.



Primeros signos de distinción entre células

Durante el desarrollo preimplantatorio se suceden una serie de pasos. El primero es la transición del control de la expresión génica de la madre al cigoto, tras dos o tres rondas de división, los transcritos heredados de la madre se degradan gradualmente y los nuevos núcleos diploides del zigoto comienzan a producir sus propios transcritos, comparado con otros organismos ocurre mucho antes en el ratón y en humano, en el estadio de dos células, y está relacionado con el inicio del programa de pluripotencia (6). Este proceso se denomina activación del genoma del zigoto. El segundo evento es la polarización apical-basal de los blastómeros en estadio de 8 células (7). Esto genera la posibilidad de crear distinción entre las células y las siguientes divisiones asimétricas darán lugar a dos tipos celulares diferenciados la MCI y el TE. El último paso es la formación del blastocisto con su distintivo eje embrionario-abembrionario. La MCI se encuentra mayoritariamente en la parte embrionaria mientras que la cavidad está en la parte abembrionaria pero ambas partes están rodeadas por TE.

Hasta el estadio de 8 células no se observan diferencias en el tamaño de las células ni en la distribución de las moléculas, es entonces cuando se empiezan a apreciar cambios en la distribución de los componentes del citoesqueleto y el embrión se empieza a compactar. Posteriormente se pueden distinguir tres tipos de división: simétrica, divisiones en las que dos células hijas heredan los dominios apical y basal; asimétrica, divisiones en las que una de las células hijas permanece polarizada y la otra no polarizada, cada una hereda uno de los dominios, apical o basal y división oblicua que es una mezcla entre estas dos categorías (8). Tras las divisiones asimétricas, las células hijas diferirán en la posición que van a ocupar dentro del embrión y en su destino, las exteriores y polarizadas se diferenciarán  en TE extraembrionario, mientras que, las interiores y no polarizadas se desarrollarán a MCI (9).

Aunque en el estadio de 16 células ya se muestran características morfológicas y moleculares diferentes, como acabamos de mencionar, las células aun muestran propiedades regulatorias, puesto que al mover una célula no polar del interior al exterior se produce su diferenciación a TE, sin embargo a la inversa no todas las células se diferencian a MCI (10). Esto puede ser debido a que en el estadio de 32 células las del linaje de TE ya están diferenciadas mientras que las células internas son pluripotentes.

Para saber si las diferencias entre células aparecen en el estadio de 16 células o anteriormente es necesario poder distinguir entre células dentro del embrión, conociendo de que parte del ovocito se han originado y si van a seguir destinos específicos o son equivalentes en sus propiedad del desarrollo. Para llegar a ese punto es esencial conocer los patrones de segmentación que generan los blastómeros, si es que realmente existen y observar el destino de su progenie.



Influencias del polo animal y la forma celular sobre la segmentación

El ovocito de ratón fertilizado parece uniforme morfológicamente, pero como producto de la segunda división meiótica el  segundo corpúsculo polar  (CP2) crea una asimetría que define el polo animal (11) creando el eje animal-vegetal, la orientación de la primera segmentación se piensa que es meridional con respecto a este eje (12).  Sin embargo puede ser que el CP2 esté cambiando su posición y ocupar ese lugar tras la división. Lo que se sabe de manera más segura  es que la primera división se da cercana al sitio de las meiosis previas (13) con una probabilidad 10 veces mayor a 30º del CP2 que en una posición perpendicular (14). Se vio que si se duplicaba el polo animal el desarrollo se para debido a anormalidades en la cromatina (15), por lo que se deduce que la relación entre spindle y orientación de la segmentación es más que una simple casusalidad. Se han visto asociados algunos miembros de la familia de las proteínas PAR al polo animal como PAR6 y PAR3 (16) que en otros modelos controlan la orientación de las divisiones celulares.

La otra asimetría que se da en el zigoto la marca el cono de fertilización que indica la posición de entrada del esperma (Sperm entre position; SEP). El ovocito se aplana como resultado de la entrada del esperma durante el proceso de fertilización, por tanto el SEP  marcará el eje corto del huevo. Algunos estudios están a favor de que la forma de la célula  junto con el CP2 van a influenciar la orientación del plano de segmentación del zigoto (16). El espermatozoide puede penetrar el ovocito de ratón por cualquier sitio a excepción del polo animal.  El SEP marca el sitio por donde se va a dar la primera división en la mayoría de los ovocitos como se pudo observar marcando el cono de fertilización con beads o mediante la tecnología de time lapse (5, 15, 17). Se ha visto que bajo condiciones normales la división se da a lo largo del eje corto del ovocito que coincide con el SEP, alineado al plano donde se encuentran los dos pronúcleos, sin embargo en experimentos realizados aplastando levemente los ovocitos y alargándolos, los pronúcleos tienden a alinearse con el nuevo eje largo formado, dándose la división a través del nuevo eje corto que separa ambos pronúcleos (16). Estos experimentos contradicen las afirmaciones de otro estudio que propone que el plano de segmentación de la primera división siempre será perpendicular al plano de alineamiento de los pronúcleos (18), esto supondría que los dos pronúcleos tendrían que fusionarse antes de la primera división y aun  no ha sido probado en humano (19). En conclusión, teniendo en cuenta estos estudios, no hay reglas estrictas para la orientación del plano de la primera división, pero en la mayoría de los zigotos se correlaciona con el polo animal y la forma celular, en última instancia viene dada por la posición de entrada del espermatozoide.  

Además estudios recientes de transcriptómica en células únicas ha demostrado la presencia de diferencias en los perfiles de expresión génica en blastómeros en estadio de dos células (20). Como la transcripción dominada por el zigoto no comienza hasta el final del estadio de dos células en ratón se piensa que esta heterogeneidad pueda ser debida a una distribución asimétrica del ARNm materno durante la división. Se tendrá que comprobar en el futuro si estas diferencias son suficientes para controlar el comportamiento celular posterior.



Patrón de segmentación y destino celular

Mediante técnicas de marcaje no invasivo e imagen 3-D se ha podido estudiar el origen y el destino de células embrionarias individuales. Estos estudios consisten en analizar la posición final que ocuparan los descendientes de cada una de las células del embrión inicial en el futuro blastocisto e incluso en el embrión post-implantatorio. Se encontró de esta manera que el CP2 además de marcar la primera segmentación, marca también la polaridad del blastocisto en las etapas iniciales (11). Además mediante marcaje no invasivo del SEP se observó que este junto con el CP2 marcan el plano de división entre dos blastómeras y en el blastocisto, el eje embrionario-abembrionario (15). Por lo que este grupo propuso la preservación del plano de la primera división, es decir, el eje animal-vegetal durante el desarrollo preimplantatorio correlacionándolo con la orientación del eje embrionario-abembrionario del blastocisto, que separa la zona donde se encuentra  la masa celular interna (MCI) y la zona opuesta sin MCI  respectivamente. Este eje divide a las células del TE en dos grupos, las cercanas a la MCI (TE polar) y las alejadas de la misma (TE mural) que tendrán destinos diferentes en el organismo. Corroborando esta idea, hay un estudio que propone que los blastómeros del estadio de dos células  muestran vías diferentes en su destino posterior (21). Ambas células contribuyen a la MCI y al TE, pero una de ellas contribuirá más a la parte embrionaria (que contiene el TE polar) y la otra a la abembrionaria (que contiene el TE mural). Aunque es importante resaltar que todos estos experimentos son únicamente descriptivos.

La orientación de la segunda división varía de unos embriones a otros, puede darse de manera meridional, similar al plano de la primera división o de manera ecuatorial, perpendicular al plano de la primera división. Aunque es posible  cualquier tipo de combinación, lo más probable es que se den divisiones meridionales y ecuatoriales de manera secuencial (12). Lo que estos estudios describen es que si la primera blastómera en dividirse lo hace meridionalmente dará lugar a dos blastómeros simétricos y equivalente en su contenido de citoplasma animal y vegetal, que contribuirán a la mayoría de las células de la MCI y el TE polar  (parte embrionaria) mientras que la otra que se divide de manera ecuatorial dará lugar al TE mural y parte de las células de la MCI, especialmente gran parte de las que limitan la cavidad del blastocisto (parte abembrionaria), una de las células tendrá contenido citoplasmático exclusivamente animal (célula superior) y otra contenido exclusivamente vegetal, y una de ellas contribuirá al TE mural casi por completo dependiendo de la posición que adquieran tras la división (13). En los casos en los que ocurre al revés y se da la orientación ecuatorial en la primera división, la primera blastómera puede dar lugar indistintamente a la parte embrionaria o abembrionaria. Y por último, si la segunda división tiene la misma orientación en las dos blastómeras,  las contribuciones se darán manera aleatoria. Este mapa de destino explica además porque algunos autores encuentran células descendientes de las 2 o 4 primeros blastómeros en ambas estructuras (MCI y TE). Por lo tanto los estudios de linaje presentan una evidencia muy clara a favor del modelo de mosaico, estando determinadas las células por su posición a contribuir a distintas regiones del blastocisto posiblemente desde la primera división embrionaria.

Los estudios centrados en conocer si el contenido citoplasmático de los blastómeros del estadio de 4 células son equivalentes utilizaron los embriones del grupo cuyas segundas divisiones se dan meridionalmente y ecuatorialmente, en este orden, para generar quimeras de 4 células idénticas en sus propiedades de desarrollo, porque es en estos embriones donde se puede conocer el origen y el destino de los blastómeros de manera individual y permite la identificación del mismo tipo de células de un embrión a otro (13). Las quimeras provenientes de la primera división meridional y que por tanto tendrán contribución citoplasmática tanto del polo animal como del vegetal, llevan su desarrollo a término, mientras que las quimeras que provienen de blastómeros que se han dividido ecuatorialmente, que solo tiene contribución de  polo animal, aunque pueden  completar su desarrollo no ocurre de manera tan satisfactoria como las quimeras meridionales, y las vegetales no pueden completarlo el desarrollo hasta la gastrulación a pesar de ser totipotentes, ya que contribuyen a los tres linajes celulares, posiblemente debido a que contienen un menor número de células EPI en la etapa de blastocisto (22). Estos descubrimientos fueron llamativos porque previamente se pensaba que los blastómeros en estadio de 4 células eran idénticas.

Estos descubrimientos solo se pueden aplicar a los embriones cuyos blastómeros en estadio de cuatro células han sido resultado de un patrón de segmentación determinado y no al resto de embriones cuyos citoplasmas se han dividido de otra manera. Es importante tenerlo en cuenta ya que parece que las diferencias entre células se dan por lo que heredan de las divisiones previas, más que por la posición que ocupan dentro del embrión en desarrollo.  Posiblemente hasta que no se comprenda la naturaleza de las diferencias entre blastómeros no se podrá comprender del todo los resultados obtenidos ni compararlos con el potencial de desarrollo de otras células que provienen de diferentes patrones de segmentación.

Sin embargo estos resultados fueron controvertidos debido a su dependencia sobre el uso del segundo cuerpo polar como un punto de referencia (18) y que no fue reproducible en diferentes laboratorios utilizando otras cepas de ratón (23).

Aunque la controversia no está completamente resuelta aun, posteriormente a los estudios formando quimeras de blastómeros del mimo tipo en estadio de 4 células de un único patrón de división tras el estadio de 2 células, los mismos autores demostraron heterogeneidades en los patrones de metilación de histonas entre esas quimeras (24), aparte de las ya demostradas diferencias en la potencia de desarrollo (13). Se vio que el blastómero que hereda la porción vegetal del ovocito, que no puede completar el desarrollo hasta la gastrulación formando una quimera de su mismo tipo, tienen el nivel más bajo de metilación en la arginina 26 de la histona H3 (H3R26me) comparado con otras blastómeros provenientes del mismo embrión de 4 células (24). Y esta heterogeneidad molecular solo se observa en este subconjunto de embriones provenientes de un tipo concreto de división. Además incrementando el nivel de H3R26me, mediante la  sobreexpresión de PRMT4,  (histona-arginina-metiltransferasa) específica para la arginina 26 de la H3, se induce la expresión de marcadores de pluripotencia como NANOG y SOX2, además aumenta la contribución del blastómero a la ICM (24), debido a un aumento en la frecuencia de divisiones asimétricas y al aumento de movimientos celulares hacia el interior tras la división, asociados a la modulación de los niveles de expresión de proteínas de polaridad, aunque se desconoce el mecanismo por el cual el nivel de H3R26me regula la expresión de genes específicos.

También se han observado diferencias en la expresión de PRDM14, que es un modificador epigenético, que puede interaccionar directamente con PRMT4. La mayor expresión del ARNm de Prdm14 se da en el estadio de 2 células y va disminuyendo gradualmente hasta el estadio de 8 células. En el estadio de 4 células es cuando se da la diferencia en sus niveles de proteína, dos de los cuatro blastómeros si muestran expresión de ARNm o proteína de PRMD14 mientras que los otros dos no muestran casi nada o nada.  La sobreexpresión de PRMD14 por microinyección de ARNm muestra altos niveles de H3R26me en los blastómeros inyectados, y las células descendientes de estas tienden a contribuir a la MCI más frecuentemente, de manera similar a la observada con la sobreexpresión de PRMT4. Sin embargo, no se sabe aun si la diferencia de expresión de PRDM14 se mantiene también en el estadio de 8 células (25).

Por último, también se han visto diferencias en las dinámicas de OCT4, un factor de transcripción clave implicado en el desarrollo temprano y la pluripotencia. Aunque OCT4 se expresa de manera uniforme en los blastómeros su motilidad en el núcleo no es la misma en todos (26). Las células exteriores en el estadio de 16 células, presentan más motilidad que las células del interior. Es probable que las células en las que OCT4 presenta  baja motilidad, el factor de transcripción se esté uniendo al ADN. Las diferencias en la motilidad de OCT4 se pueden distinguir desde estadios de 4 y 8 células. En embriones de estadio de 8 células, los blastómeros con baja motilidad de OCT4 tienden a dividirse asimétricamente hasta formar el estadio de 16 células, y los que presentan alta motilidad de OCT4 se dividen de manera simétrica.  Por lo tanto, la contribución diferencial a los dos linajes de los primeros blastómeros podría ser una consecuencia de la frecuencia en la que se dé la división simétrica en los blastómeros, lo que limita sus posibilidades de contribuir a la MCI. Lo que aun no se ha podido correlacionar es la motilidad de Oct4 con la expresión de PRDM14 o el nivel de H3R26me.



Division asimétrica: Generación de células internas y externas

En el estadio de 8 células, los dos procesos que tienen lugar son la compactación y la polarización. Al comienzo de la compactación los blastómeros son esféricos y se distinguen unos de otros. Cuando se da la compactación, se aplanan unas contra otras minimizando el área de superficie total del embrión, volviéndose cada blastómero morfológicamente indistinguible. La compactación y la formación del blastocisto son dependientes  de E-cadherina and β-catenina (27).

En el estadio de 8 células también se da la polarización, donde se establecen los dominos apical-basal. El dominio apical esta enriquecido en F-actina y un complejo proteico apical altamente conservado en la evolución que contiene PAR3 (PARD3), PAR6 (PARD6) y una proteína quinasa C (aPKC) (28). Este complejo apical juega un papel importante en la formación del dominio apical del blastómero.

Tras la compactación y la polarización cada blastómero del embrión en estadio de 8 células se divide o bien simétricamente (las dos células hijas heredan parte del dominio apical, dando como resultado dos células polares) o asimétricamente (solo una de las células hijas hereda el dominio apical, cuyo resultado será una célula polar y la otra apolar). Como la superficie apical se sitúa en la superficie del embrión se pensaba que los ángulos de división regulaban la herencia de este dominio y por  tanto el destino de las células hijas, si se dividían de manera planar sería una división simétrica y de forma ortogonal, asimétrica (28). Sin embargo, se ha comprobado que no es tan simple, las células se pueden dividir de forma oblicua y por tanto el ángulo de división no es un predictor fiable de las divisiones simétricas o asimétricas ni de la posición final (29).

Se ha visto que células localizadas en la superficie del embrión pueden internalizarse tras la división del estadio de 8 células (29). Además se demostró que el mecanismo que media la internalización son comportamientos celulares activos (30). El estudio se centró en la herencia del dominio apical tras la división del estadio de 8 células demostrando que las células externas apolares son internalizada en vez de adoptar polaridad. Observaron que la superficie que no establece contacto con otras células de las células apolares exteriores presenta mayor nivel de contractibilidad por actomiosina que se ocupa de su internalización. Por lo que a partir de ahora la definición de división simétrica/asimétrica se debería de definir como la herencia del dominio apical más que como los ángulos de división, y que la constricción apical inicia la internalización de las células apolares para establecer la configuración de las células internas y externas según sean apolares o polares.

Por último, aunque la frecuencia de divisiones asimétricas define la proporción de células TE/MCI en el embrión, aun no está claro como se regula esta frecuencia. Hay una amplia variación de la frecuencia de divisiones asimétricas en la transición del estadio de 8 células al de 16. En algunos embriones de 8 células, todos los blastómeros se dividen asimétricamente generando 8 células polares y 8 polares en el estadio de 16 células (30), mientras que en otros embriones solo se dan una o dos divisiones asimétricas. Parece que hay factores como el tamaño del dominio apical, la posición del núcleo o los contactos célula a célula que podrían estar afectando la frecuencia de con la que se dan las divisiones asimétricas más que el hecho de que esté predeterminado. También se sabe que el embrión tiene mecanismos de compensación, si el número de divisiones asimétricas es muy baja en la transición de 8 a 16 células, mas células en este estadio se dividirán asimétricamente para compensar el número de células internas. La regulación de la frecuencia de divisiones asimétricas y la compensación en el número de células internas no se conoce como funcionan aun.



Genes implicados en la diferenciación a TE/MCI

Se ha relacionado la cascada de señalizazion Hippo/YAP, una vía de control de crecimiento, con la expresión de genes específicos de TE, por lo que juega un papel central en la diferenciación de los linajes TE/MCI. YAP actúa como activador transcripcional, puede encontrarse en el núcleo o en el citoplasma si se trata de su forma forforilada. En el TE, YAP se transloca al núcleo para activar genes específicos de este linaje como Cdx2 o Gata3 (31), mientras que en la MCI, una quinasa lo fosforila secuestrándolo de esta manera en el citoplasma. Esta actividad diferencial de la cascada de señalización YAP/Hippo solo se requiere por un periodo corto de tiempo hasta que se establecen patrones de expresión diferenciales entre el TE y la MCI (32).  Además, aunque se puede modular la cascada de señalización YAP / Hippo para desactivar la expresión CDX2 en células del TE, no es suficiente para cambiar la posición celular y el estado de la polaridad celular.

CDX2 es un factor tanscripcional que se expresa específicamente en el TE y es esencial para que sea funcional. Si Cdx2no está presente, se expresan  en el TE genes marcadores de totipotencia exclusivos de la MCI, como son Oct4 y Nanog, lo que sugiere que la represión transcripcional de Oct4 y Nanog es dependiente de CDX2. Se ha propuesto que la expresión especifica de CDX2 en TE se deba a la localización apical de su ARNm en las células polares debido a una división asimétrica (33).

Para que se active la vía de señalización Hippo en las células interiores (MCI) es necesario NF2, una proteína que actúa sobre la quinasa encargada de fosforilar a YAP. La cascada de señalización YAP/Hippo no solo regula genes específicos del TE sino que también restringe la expresión de SOX2 a la MCI, que es uno de los marcadores más tempranos de las células del interior del blastocisto. En este caso el mecanismo de represión que activa YAP es independiente de CDX2 y por tanto diferente de la regulación de NANOG y OCT4 (34).



Diferenciación de la MCI en dos linajes: epiblasto y endodermo primitivo

Una vez que las células de la MCI son internalizadas, se diferencian en dos linajes diferentes: epiblasto (EPI), que es pluripotente y produce todas las células fetales, y endodermo primitivo (PE), que contribuye principalmente al saco vitelino extraembrionario. Este es un proceso de múltiples pasos que comienza con la especificación entre  EPI / PE y es seguido por la maduración hacia uno de los linajes, es decir, se establecen redes específicas de genes y se diferencian dentro de cada linaje por último las células se  clasifican de células para formar dos compartimentos distintos: un clúster de EPI y un epitelio PE.

Los factores de transcripción NANOG y GATA6 son los primeros marcadores de los linajes EPI y PE, respectivamente (35). Ambos están presentes en todas los blastómeros en el estadio de 8 células, pero aproximadamente en el estadio de 32 células, las células de la MCI van a expresar o bien NANOG, llevándoles al destino de EPI, o bien GATA6, llevándoles a formar parte del PE (36). Esto da lugar a un patrón de expresión que es mutuamente exclusivo en día 3,75 tras la fertilización. Este proceso ocurre de manera asíncrona en células individuales, entre los días 3,0-3,75. Ambos factores de transcripción se pueden identificar en algunos embriones en día 3,75, y la aparición de células de EPI (NANOG+/GATA6-) es el primer paso conocido del proceso de especificación.

En el estadio de 8 células los niveles de expresión de Nanog y Gata6 son relativamente altos (36), por lo que el mecanismo que controla el proceso de especificación de linaje es probable que actúe  disminuyendo los niveles de ARNm selectivamente, en lugar de a través de un aumento selectivo en la transcripción. La especificación de uno de los dos linajes se puede observar a nivel de proteína como una combinación de un aumento en la expresión de uno de los factores de transcripción  y la disminución del otro (36, 37). Mediante estudios de inmunoprecipitación de la cromatina realizados en células madre embrionarias (ESCs) se han podido identificar los sitios de unión al ADN de NANOG y GATA6 y se ha visto que se reprimen el uno al otro.

La señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF) juega un papel esencial durante la formación del linaje del PE. Fcfr2 se expresa en la MCI temprana antes de que se diferencie a PE (Día 3,25) por lo que las células tempranas de la MCI deben de ser capaces de responder a los ligandos de la familia de FCF. La expresión de Fcf4 se produce cuando hay expresión de Nanog y actúa sobre las células de la MCI para que adopten el destino de PE (35) si la señalización mediada por FCF está bloqueada será suficiente para que todas las células de la MCI se conviertan a EPI. Además, FCF4 puede reprimir la expresión de NANOG sin la presencia de GATA6, mientras que si se bloquea la señalización de FCF se puede reprimir la expresión de GATA6 sin necesidad de presencia de NANOG. Sin embargo, estas inhibiciones tienen que darse antes del estadio de compactación, antes de que NANOG y GATA6 empiecen a expresarse, porque sus expresiones se vuelven insensibles en estadios posteriores. En resumen, la señalización por FCF, NANOG y GATA6 forman parte de una red de regulación que dirige el proceso de especificación. La proporción de células EPI/PE dentro de la MCI será regulada por los niveles relativos de cada uno de los componentes de la red en cada célula (37). Por ejemplo reduciendo los niveles de expresión de Fcf4 incrementa el número de células de EPI que expresan NANOG.

Recientemente se ha creado un modelo matemático que incluye los factores implicados en la red de regulación EPI/PE (37) para explicar cómo se establece el patrón mutuamente exclusivo en las células de la MCI. Este modelo considera la represión mutua entre NANOG y GATA6 además de su propia activación y la señalización del FCF regulando positivamente a GATA6 mientras que inhibe NANOG. Con estas condiciones iniciales fijadas, el modelo es capaz de recapitular el proceso de desarrollo que ocurre in vivo. Las simulaciones muestran que una o pocas células promueven la expresión de NANOG en la MCI temprana produciendo un incremento en la secreción de FCF4. Esta alta concentración extracelular local de FCF4 induce el destino a PE de las células vecinas, sugiriendo que las células de la MCI de manera individual pueden adoptar destinos diferentes asíncronamente basándose en la concentración local de FCF4. Es necesario especificar que aunque en día 3,75 la mayoría de las células de la MCI concretan su destino, aun retienen su plasticidad de cambiar a un destino alternativo, bien modulando la señalización mediente FGF o cambiando a sus células vecinas por otras mediente transplante de células. La plasticidad desaparece en dia 4, primero la pierden las células del EPI, debido probablemente a que especifican su destino de manera más temprana que las del EP.

A pesar del conocimiento de la red FGF-NANOG-GATA6, no se conoce aun cual son los eventos que tienen lugar para marcar estas primeras pequeñas diferencias en las células de la MCI. Las simulaciones matemáticas que imitan altos niveles de la transcripción de todos los factores básicos indican que este ruido interno es poco probable que sea el mecanismo de iniciación. Aunque si se sabe que el paso inicial es la especificación del destino en día 3,0 de una o unas pocas células de la MCI a EPI, siempre precediendo a la especificación de PE en otras células, todavía no se conoce por qué FGF4 y / o la expresión de NANOG se incrementa en sólo unas pocas células de la MCI.



DISCUSIÓN

El conocimiento detallado de la formación del ovocito humano, su crecimiento, fertilización, desarrollo preimplantatorio y auto-organización es esencial para proporcionar conocimientos clínicos para la reproducción humana asistida y para apoyar enfoques de reprogramación celular, dado el reciente reconocimiento de varios estados pluripotentes en células madre in vitro.

Sin embargo, en la actualidad siguen existiendo dos modelos sobre el desarrollo preimplantacional. El primero asegura que el embrión es totalmente simétrico, no presenta un patrón de división y como consecuencia las orientaciones de las divisiones son totalmente aleatorias (18, 23). De acuerdo con este modelo las primeras diferencias entre células no aparecen hasta la cuarta división  y se darían por la posición que ocupan las células dentro del embrión, interior o exterior. Los ejes embrionarios no se establecen hasta el proceso de gastrulación en el epiplasto embrionario derivado de la MCI y mediante interacciones celulares complejas. De hecho esta fase se considera como el momento en el que la estructura definitiva del organismo se establece y por lo tanto uno de los momentos más transcendentales del desarrollo embrionario. Y el segundo modelo, el de mosaicismo que propone que existen diferencias entre células que se pueden detectar antes de que estas adopten posiciones diferenciales dentro del embrión, porque las diferencias dependerán de la orientación de las divisiones celulares a lo largo del eje animal-vegetal (11, 38, 13, 17). Este modelo está apoyado por los grados potencia de desarrollo que presentan cada uno de los blastómeros en el estadio de 4 células que parecen depender de modificaciones epigenéticas ya que se han encontrado diferencias en el patrón de metilación de histonas (13, 24). Sin embargo esta postura sugiere que patrón y flexibilidad no están reñidos y si existen reglas desde estadios tempranos estas no deben ser estrictas porque es de sobra conocida la capacidad del embrión de adaptarse a cambios si es perturbado, por ello es importante que las técnicas de estudio no sean invasivas. Los análisis de marcaje siempre presentan objeciones técnicas por el abordaje experimental que conlleva, con un gran intervencionismo sobre el embrión (manipulación, introducción de sustancias extrañas, métodos de observación del marcaje como la fluorescencia, etc) y por lo tanto resultan controvertidos.

Lo que es seguro es que la primera decisión celular es tomar una dirección hacia el linaje de TE o MCI,  aunque aún queda por determinar cómo surgen las primeras diferencias entre blastómeros,  y si de alguna manera pueden regular la expresión genética para dirigir el destino celular hacia alguno de los linajes. Además también deben de tenerse en cuenta las contribuciones maternas en los primeros estadios

Aunque en última instancia estos estudios pretenden lograr una comprensión del desarrollo humano temprano y de los estados pluripotentes humanos a veces es complicado extrapolar los conocimientos obtenidos en el modelo de ratón. Hay paralelismos claros entre el desarrollo preimplantacional humano y murino, las redes transcripcionales específicas de linaje parecen estar conservadas en ambos, sin embargo, las vías de señalización que regulan la especificación de linaje pueden divergir. Durante la especificación entre los linajes EPI/PE la expresión de NANOG y GATA6 es probablemente común a todos los mamíferos. Pero por otro lado, la decisión entre estos dos linajes no parece tan dependiente  de la señalización mediante FCF, ya que su bloqueo o inducción no parece impactar de manera tan fuerte en humano como lo hace en ratón (39). La importancia de varias vías de señalización puede haber evolucionado de manera diferente en diversas especies de mamífero para inducir las mismas redes de transcripción que decidirán el linaje en el que diferenciarse.


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