Utilización de parámetros objetivos morfométricos para la evaluación de la calidad embrionaria

INTRODUCCIÓN

En los últimos veinte años, el uso de las Técnicas de Reproducción Asistida (TRA) se ha extendido considerablemente. Actualmente, el número de niños concebidos por Fecundación In Vitro y por Inyección Intracitoplasmática de espermatozoides (FIV-ICSI) representa entre el 2% y el 4% de los nacimientos anuales en Europa (1).

Sin embargo, también se ha incrementado de una manera preocupante el riesgo de gestaciones múltiples. Así, en España, la frecuencia de gestaciones gemelares y triples en 1990 era de 75 y 1, respectivamente, por cada 10.000 nacimientos, mientras que en el año 2012 estos valores han aumentado hasta alcanzar los 168 partos gemelares y ocho triples cada 10.000 nacimientos (2).

La disminución de las gestaciones múltiples mediante la limitación del número de embriones a transferir es uno de los principales objetivos de las Técnicas de Reproducción Asistida (3, 4).

En nuestro país, la Sociedad Española de Fertilidad (SEF) y la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR) tienen grupos de interés específicos que se centran en el estudio del número de embriones a transferir en función de la calidad embrionaria y de la situación clínica de cada pareja, con el fin de reducir al máximo las gestaciones múltiples (5, 6).

Para disminuir el número de embriones a transferir sin afectar las tasas de gestación y de implantación es imprescindible desarrollar nuevas herramientas de selección embrionaria que permitan seleccionar a los embriones con un mayor potencial de implantación.

La evaluación tradicional basada fundamentalmente en criterios morfológicos de los embriones posee una serie de limitaciones asociadas al método utilizado. Es altamente subjetivo, presenta un relativo poder predictivo y una gran variabilidad inter- e intra-observador que limita su valor pronóstico.

Para disminuir la subjetividad de las clasificaciones embrionarias actuales, se deberían desarrollar herramientas que nos permitan obtener las medidas directamente del embrión sin que participe la opinión del observador con lo que podríamos obviar la subjetividad de la medida. El análisis de imagen y el diseño de variables morfométricas embrionarias nos permitirían desarrollar un sistema de clasificación embrionario más objetivo.

En la revisión bibliográfica realizada se han encontrado estudios que utilizan la morfometría para analizar variables embrionarias. En estos estudios se han relacionado variables morfométricas embrionarias con calidad embrionaria; segmentación embrionaria y reconstrucción en 3 dimensiones (3D); así como con fragmentación y multinucleación (7-11).

En anteriores trabajos realizados por nuestro equipo (12-14) se estableció un perfil del embrión con mayor probabilidad de implantar basado en la combinación de variables morfológicas y morfométricas para embriones en día 2 de desarrollo.

El objetivo del presente trabajo es construir un modelo de implantación embrionaria basado en la combinación de variables morfológicas y morfométricas en aquellos casos en los que conocemos el destino exacto del embrión (0 y 100% de implantación)  y validar la eficiencia del modelo estadístico incluyendo los grupos de implantación 33%, 50% y 66%.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

1-Tipo de estudio

Estudio retrospectivo de los embriones transferidos en la Unidad de Reproducción Humana Asistida del Hospital Universitari i Politècnic La Fe de Valencia desde Enero hasta Abril de 2010. Solo se incluyeron los primeros y segundos ciclos de FIV-ICSI, y los ciclos con endometriosis y baja respuesta fueron excluidos.

Se utilizaron 219 embriones procedentes de 112 ciclos de FIV-ICSI.

Se transfirieron 1, 2 ó 3 embriones seleccionados en día 2 de desarrollo en función de su disponibilidad y de la edad de la mujer.

Los embriones fueron fotografiados inmediatamente antes de su transferencia mediante el software Cronus 3 (Research Instruments LTD) y posteriormente las imágenes fueron almacenadas en la base de datos de este hospital.

2. Variables estudiadas

Se consideraron las variables morfológicas más utilizadas para la selección de los embriones de mejor calidad (5), y por otra parte, las variables morfométricas que proporcionan un mayor conocimiento de las características del embrión en su conjunto.

 

2.1. Variables embrionarias morfológicas

Se estudiaron las siguientes variables morfológicas: número de células, simetría y grado de fragmentación de las blastómeras y anomalías estructurales de la zona pelúcida (abultamientos y engrosamientos).

El número de células (NC) se considero como una variable cuantitativa con cinco niveles: embriones de 2 células (nivel 1); embriones de 3 células (nivel 2); embriones de 4 células (nivel 3);  embriones de 5 células (nivel 4) y embriones de 6 células (nivel 5).

La simetría (SIM) se evaluó como una variable cualitativa siguiendo los criterios descritos por Handarson (18). Los embriones con una diferencia en el tamaño de sus blastómeras > 20% se consideraron asimétricos y se establecieron 2 niveles: embriones simétricos (1) y embriones asimétricos (0).

La fragmentación embrionaria (FRAG) se evaluó siguiendo los criterios descritos por Alikani (19) y se consideraron 4 niveles dependiendo de sus porcentajes de fragmentación: Nivel 1 fragmentación < 10%, nivel 2 fragmentación comprendida entre el 11-25%, nivel 3 fragmentación comprendida entre el 26-35% (2) y nivel 4 fragmentación > 35%.

Las anomalías de la ZP se evaluaron siguiendo las recomendaciones de Gabrielsen (20) y solo se incluyeron las irregularidades (abultamientos y engrosamientos). Se establecieron 2 niveles: ausencia (0) y presencia (1) de anomalías en la ZP.

Al tratarse de embriones seleccionados para su posterior transferencia, el 95% de estos embriones presentaron blastómeras mononucleadas. Por esta razón no se incluyó esta variable ya que no se disponía de suficientes imágenes de blastómeras multinucleadas para su análisis estadístico posterior.

Las variables morfológicas se evaluaron inmediatamente antes de la transferencia y a continuación los embriones fueron fotografiados para la evaluación posterior de sus parámetros morfométricos.

 

2.2. Variables embrionarias morfométricas

Se estudiaron aquellas variables morfométricas que nos proporcionan información sobre características de los embriones que no podemos obtener con las variables morfológicas.

Para evaluar el tamaño del embrión y de sus blastómeras se utilizó la variable perímetro embrionario (PE) y perímetro medio de todas sus blastómeras (PMB).

Para estudiar la forma del embrión y de cada una de sus células se utilizó la variable factor de circularidad embrionario (FCE) y factor de circularidad medio de todas las blastómeras (FCB).

También se incluyeron las variables morfométricas porcentaje de fragmentación morfométrico (FRAGM) y espesor de la zona pelúcida (EZP) para poder establecer una comparación con las correspondientes variables morfológicas fragmentación y alteraciones de la zona pelúcida.

El sistema de captura de imágenes consta de un microscopio invertido de contraste de fases (Olympus) con una magnificación óptica de 10X y óptica de Hoffman junto con su respectivo software. La clasificación morfométrica se llevó a cabo utilizando imágenes capturadas digitálmente con el procesador de imágenes Cronus 3 “video capture and embryo analysis software”. Posteriormente dichas imágenes fueron analizadas mediante el software ImageJ y las herramientas de las que dispone.

Para la cuantificación de los parámetros embrionarios se empleó el programa de análisis de imagen ImageJ, un programa de dominio público diseñado por Wayne Rasband (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Se eligió este programa por su precisión en la evaluación de las características embrionarias y por el gran número de herramientas disponibles que nos permiten ajustarnos mejor a las características de los embriones analizados disminuyendo así el error experimental asociado al observador.

Previamente al proceso de análisis tuvo que calibrarse y adaptarse el programa de análisis de imagen. El programa ImageJ utiliza el píxel como unidad de media para todas las distancias y longitudes analizadas en la fotografía; por ello hubo que realizar un cambio de unidades de píxeles a micras (μm), unidad de medida utilizada para medir los elementos embrionarios. Para ello se empleó una fotografía de un micrómetro objetivo, cuyas dimensiones son conocidas, realizada con el mismo microscopio con el que se fotografiaron los embriones, y a los mismos aumentos (10X).

Para llevar a cabo la medida del perímetro del embrión, se empleó la herramienta “Elliptical or brush selection” del programa y se ajustó la elipse descrita por el programa a la periferia del embrión, de manera que ambas siluetas coincidieran en el mayor número de puntos posibles para que los datos de la medida obtenidos fueran precisos

Para el porcentaje de fragmentación se utilizó la herramienta “Cell Counter” y se determinó el porcentaje de fragmentación contando el número de fragmentos presentes en el embrión. Se siguieron los mismos criterios de clasificación utilizados para la evaluación morfológica de la fragmentación embrionaria.

También se midió la variación del espesor de la ZP en tres puntos para cada uno los embriones en estudio y posteriormente se hizo la media en todos los casos. La herramienta empleada para ello fue “Straight segmented or freehand line sor arrows” mediante la que se obtuvieron medidas del espesor de la ZP basadas en la anchura de la misma en diferentes puntos de la cubierta del embrión

La forma del embrión y sus blastómeras se evaluó estudiando el factor de circularidad. El factor de circularidad o roundness compara el área de un objeto, en este caso un embrión, con el área de un círculo cuya circunferencia es igual al perímetro del objeto. Los valores oscilan entre 0 y 1, siendo 1 el máximo valor corresponde a la unidad, lo que en este caso equivaldría a un embrión de forma circular.

 

3. Estudio estadístico

Se utilizó modelo lineal generalizado (15) para estudiar la trazabilidad del embrión desde la transferencia hasta la implantación incluyendo los ciclos en los que el número de embriones transferidos coincidió con el número de sacos observados por ecografía: ciclos que no dieron lugar a gestación, ciclos con transferencia de un único embrión que dieron lugar a gestaciones simples y ciclos con transferencia de dos embriones que resultaron en gestaciones dobles. No se obtuvieron gestaciones triples. Las variables con pocas diferencias entre sus valores se consideraron como categóricas o factores (16). El modelo fue validado mediante la utilización de curvas ROC incluyendo aquellos ciclos en los que el número de sacos observados por ecografía fue menor que el número de embriones transferidos (implantación 33% y 50%).  Para la comparación de los modelos llamado se utilizó el AUC o área bajo la curva ROC. AUC toma valores entre 0 y 1, donde 0.5 corresponde a clasificaciones aleatorias de los individuos, el modelo será mejor cuanto mayor sea su AUC.

 

RESULTADOS

En la Tabla 1 se presentan las variables más significativas tras realizar un primer ajuste con todas las variables y aplicar un método de selección de variables incluyendo únicamente las variables más significativas evitando la multicolinealidad.

Las únicas variables con coeficientes de correlación significativos fueron la variables morfológicas número de células (NC), y las variables morfométricas fragmentación (FRAGM), perímetro embrionario (PE), factor de circularidad embrionario (FCE) y espesor de la ZP (EZP) .

La variable morfológica NC presentó un coeficiente de correlación positivo con diferencias significativas entre los niveles 2, 3 y 4 respecto a los niveles 1 y 5, indicando que los embriones de 3, 4 y 5 células tendrán mayores probabilidades de implantar que los de 2 y 6 células.

Sin embargo, las variables morfométricas relacionadas con la forma y el tamaño del embrión y con el espesor de la ZP presentaron coeficientes de correlación negativos. Indicando que los embriones de menor tamaño (menor PE), con forma elíptica (menor FCE) y menor espesor de la ZP (EZP) tendrán más probabilidades de implantar.

A partir del modelo se pueden calcular las tasas de implantación porcentuales que corresponden a cada combinación de variables para cada uno de los embriones. Con estos valores se puede establecer un ranking de calidad de los embriones en función de su implantación. Este ranking es especialmente útil en los casos más conflictivos en los que no disponemos de embriones de buena calidad

Del mismo modo, se ha considerado un modelo similar para las variables morfométricas de las blastómeras, lo que nos ha permitido asignar puntuaciones a cada una de las blastómeras de un embrión. Sumadas las puntuaciones de las blastómeras de un mismo embrión, obtenemos la puntuación que le corresponde a cada embrión en función de las características morfométricas de las mismas. Esta variable ha resultado no significativa en presencia del resto de características del embrión. Por lo que a partir de nuestros resultados también se deduce que resulta irrelevante y por tanto, no es necesario descender a valorar las características morfométricas de las blastómeras de un embrión.

Para validar nuestro modelo, con las puntuaciones de los embriones, hemos calculado la AUC correspondiente a las variables morfológicas utilizadas para la selección embrionaria previa a la transferencia y el AUC correspondiente a las puntuaciones de los embriones cuando incluimos las variables que alcanzaron significación estadística en nuestro modelo con variables morfológicas y morfométricas.

El AUC para las variables morfológicas es de 0.6387. Sin embargo, el AUC correspondiente para las variables morfométricas más significativas es de 0.8494. Lo que demuestra que las nuevas características aumentan el valor discriminante del modelo y permiten seleccionar los embriones con mayor potencial de implantación.

En la Figura 1 se muestra las curvas ROC correspondientes a los dos modelos cuya comparación nos permite afirmar que la puntuación que asigna el modelo que incorpora variables morfológicas y morfométricas discrimina mejor entre los embriones que implantan y los que no implantan ya que proporciona una curva más cercana a la diagonal.

DISCUSIÓN

Uno de los objetivos prioritarios de las URHA es la obtención de recién nacidos sanos evitando gestaciones múltiples. La implantación embrionaria está directamente relacionada con el número y la calidad de los embriones transferidos (21-23). Por lo tanto, es imprescindible encontrar marcadores de calidad embrionaria que nos permitan transferir los embriones de mejor calidad, disminuyendo el número de embriones a transferir y reduciendo a su vez las gestaciones múltiples sin que las tasas de gestación globales se vean afectadas.

Una de las principales razones por las que no disponemos de marcadores de calidad embrionaria es que no conocemos el destino de los embriones transferidos. La falta de trazabilidad de los embriones en los ciclos de FIV-ICSI en los que transferimos más de un embrión, es uno de los principales impedimentos para realizar estudios potentes sobre la capacidad predictora de implantación de las variables morfológicas analizadas (23). En la práctica clínica se transfieren 2 embriones siempre que haya embriones disponibles para la transferencia; por lo tanto, no es posible conocer las características del embrión que implantó cuando el número de embriones transferidos es mayor que el número de sacos gestacionales observados ecográficamente.

Los criterios de selección embrionaria actuales basados en variables morfológicas, tales como el número de células, el porcentaje de fragmentación y la simetría e igualdad de las blastómeras, tienen un valor subjetivo (24) y suponen una alteración en las condiciones de cultivo al tener que sacar los embriones del incubador cada vez que se realiza la correspondiente clasificación morfológica (25).

En la literatura consultada se han encontrado escasas referencias sobre la utilización de cualidades objetivables de la morfología de los embriones Es decir, medidas obtenidas directamente del embrión que pudieran utilizarse de forma ajena a la opinión del observador, obviando totalmente la subjetividad de la medida.

Se han realizado trabajos en los que se relacionan variables morfométricas embrionarias con calidad embrionaria; segmentación embrionaria y reconstrucción en 3 dimensiones (3D); así como con fragmentación y multinucleación (7-11); sin embargo no se ha encontrado ningún trabajo que se centre en la comparación de variables morfométricas en función de la implantación.

En anteriores trabajos (12, 26) se compararon variables morfológicas y morfométricas en embriones con destino conocido (0 y 100% de implantación). Las variables morfométricas resultaron más objetivas y presentaban unos niveles de significación estadística mucho más elevados que las variables morfológicas. Además, se obtuvo un perfil del embrión con mayor probabilidad de implantar basado en la combinación de variables morfológicas y morfométricas. Los embriones con mayores posibilidades de implantar presentaban 4 células en día 2 de desarrollo con unos porcentaje de fragmentación menores del 35% con todas las blastómeras embrionarias con forma elipsoidal (factor de circularidad del orden de 0,9), con una media para el radio de cada blastómero de 32 micras y un espesor medio de la ZP de 13 micras aproximadamente (12).

Las únicas variables que han alcanzado significación estadística en nuestro modelo de implantación embrionario fueron el número de células, la fragmentación embrionaria evaluada con la herramienta cell counting, el perímetro embrionario como medida del tamaño del embrionario, el factor de circularidad como medida de la forma y el espesor de  la zona pelúcida.

El número de células es uno de los marcadores morfológicos más fuertemente relacionado con el potencial de implantación (27, 28). El estadio ideal de división en embriones en día 2 es de cuatro células, disminuyendo el potencial de implantación cuando el número de células aumenta o disminuye. Los resultados de nuestro estudio indican que el número de células del embrión es una variable morfológica no subjetiva y que debe permanecer en cualquier sistema de clasificación embrionaria. Los embriones de 3, 4 y 5 células en día 2 presentan unas tasas de implantación significativamente superiores a las obtenidas para los embriones de 2 y 6 células. Estos resultados coinciden con los obtenidos previamente por muchos grupos de investigación (28-30).

En relación con el porcentaje de fragmentación embrionario, el principal problema se debe a que se desconoce el porcentaje de fragmentos por encima del cual se ve comprometida la capacidad del embrión para llevar a cabo la implantación (27). De los resultados obtenidos en el presente trabajo podemos indicar que fragmentaciones inferiores al 25% del volumen del embrión no comprometen la implantación del mismo. Sin embargo, fragmentaciones superiores al 35% presentan unas tasas de implantación significativamente inferiores. Estos resultados coinciden con los propuestos por otros autores (28, 31, 32). Estos resultados estarían de acuerdo también con los propuestos por Holte en el caso de fragmentaciones severas, es decir, porcentajes de fragmentación mayores del 50% (23).

Molina et al 2011 (12) demuestran que la variable morfométrica fragmentación evaluada con la herramienta cell counting presenta una correlación mayor con la implantación que esta misma variable evaluada morfológicamente por simple apreciación visual. Del mismo modo, en el presente trabajo se demuestra que la fragmentación es una variable incluida en el modelo de implantación y que además este porcentaje de fragmentación debería evaluarse como variable morfométrica utilizando la herramienta Cell Counting.

En relación con la evaluación de la forma del embrión mediante la utilización de la variable morfométrica factor de circularidad, también queda incluida en el modelo de implantación, indicando que aquellos embriones con forma elipsoidal con muy baja excentricidad presentarán unas mayores probabilidades de implantar. Desconocemos las causas fisiológicas que determinarían esta mayor implantación de los embriones con menor factor de circularidad.

En cuanto al tamaño del embrión, el perímetro embrionario también alcanzó significación en nuestro modelo, indicando que los embriones de menor tamaño presentaban una mayor probabilidad de implantar. En anteriores trabajos realizados por nuestro equipo (12) se observó que los embriones que implantaron presentaban un perímetro significativamente menor que el de los embriones que no implantaron. Este menor perímetro embrionario vendría determinado por el menor tamaño de las blastómeras de los embriones que implantaron. Sin embargo, en el momento actual, desconocemos la causa biológica que pueda ocasionarlo.

En relación con el estudio de la ZP, podemos concluir que la valoración de las irregularidades en la superficie de la zona pelúcida es subjetiva e inexacta, por lo que se plantea la utilización de la variable morfométrica espesor de la ZP que también demostró su mayor capacidad para predecir tanto gestación como implantación embrionaria (20, 33, 34). El grosor de la zona pelúcida influye sobre la capacidad del embrión para desarrollarse y poder implantar en el endometrio materno (20), por tanto, del presente estudio es posible concluir que los embriones con un espesor de la ZP menor tienen más probabilidades de implantar con éxito, coincidiendo estos resultados con los propuestos por el grupo de investigación que estudió morfométricamente el espesor de la zona pelúcida y su relación con la implantación embrionaria (35).     

Todo ello pondría de manifiesto que las variables morfométricas embrionarias: porcentaje de fragmentación, perímetro embrionario, factor de circularidad y espesor de la zona pelúcida junto con la variable morfológica número de células, serían las más relacionadas con el fenómeno de la implantación. Sin embargo, dichos valores no deben utilizarse como predicciones sino para elaborar un ranking de la calidad de los embriones en función de su implantación. Por lo tanto, con el modelo se pueden calcular las tasas de implantación porcentuales de cada embrión a partir de la  combinación de las variables número de células, forma, tamaño, fragmentación morfométrica y espesor de la zona pelúcida. Con estos valores el modelo puede establecer un ranking de calidad de los embriones y nosotros elegiremos para la transferencia aquellos embriones con mayor puntuación. Este ranking, es especialmente útil en los casos más conflictivos en los que no disponemos de embriones de buena calidad o bien todos los embriones son de buena calidad. En estos casos la forma, el tamaño del embrión y el espesor de la ZP nos permitirán seleccionar los mejores embriones.

Además, la mayor AUC obtenida para la curva ROC correspondiente a las variables que fueron significativas en nuestro modelo (AUC 0.8093), en comparación con el AUC de las variables morfológicas utilizadas para la selección embrionaria previa a la transferencia (AUC 0.6216), indicaría que las nuevas características morfométricas aumentan el valor discriminante del modelo y permiten seleccionar los embriones con mayor potencial de implantación.

En relación con la forma de las blastómeras, evaluada como factor de circularidad no fue incluida en el modelo de implantación como tampoco quedaron incluidas ninguna de las variables morfométricas correspondientes a las células embrionarias. Sin embargo, en anteriores trabajos (12), se demostró que el factor de circularidad de las blastómeras permitía evaluar la simetría y/o igualdad y presentaba diferencias significativas en función de la implantación. Sin embargo, el bajo número de embriones con 100% de implantación podría dejar fuera de este modelo otras variables tanto morfológicas como morfométricas estrechamente relacionadas con la implantación.

En cualquier caso, consideramos que la evaluación de la simetría por una simple apreciación visual es demasiado subjetiva y que tal vez, la simetría y/o igualdad de las blastómeras deberían estudiarse y calcularse mediante el factor de circularidad de las blastómeras que sería una variable más exactas y más sencillas que nos permitirían agrupar las variables simetría e igualdad en una única variable.

La incorporación de estas variables morfométricas a los sistemas de clasificación embrionaria actuales permitiría mejorar considerablemente la selección embrionaria previa a la transferencia.

En futuros trabajos, se considerarán únicamente transferencias de 2 embriones de 4 células con unos porcentajes de fragmentación < 25% y se compararán las variables morfométricas en los grupos de implantación 0, 50 y 100% con el fin de comprobar si el modelo incluye alguna variable morfométrica de las células del embrión.

Posteriormente se contrastará su utilidad clínica con carácter prospectivo mediante la realización de un estudio prospectivo en el que se realizarán transferencias de un único embrión seleccionado (SET) en día 2 (48 horas post- inseminación) en mujeres jóvenes con riesgo de gestación múltiple.

 

CONCLUSIONES

El número de células, el perímetro embrionario, la fragmentación evaluada morfométricamente, el factor de circularidad embrionario y el espesor de la zona pelúcida son variables objetivas para predecir la implantación.

Las variables morfométricas presentan una mayor capacidad discriminante.

Las variables morfológicas PFRAG y AZP deberían evaluarse como variables morfométricas.

Estas variables son una herramienta objetiva, rápida, eficaz y precisa. Su incorporación en los sistemas de clasificación embrionaria permitiría mejorar los resultados y ayudaría a reducir las tasas de embarazo múltiple.