Evaluación de la motilidad espermática usando dos crioprotectores

INTRODUCCIÓN

La infertilidad es un fenómeno que afecta aproximadamente al 15 % de las parejas que intentan concebir.  En la actualidad las causas más comunes de infertilidad son la edad materna y el fallo en la función espermática; en casi la mitad de los casos de infertilidad masculina la causa radica en una hipofertilidad exclusiva o asociada a la femenina (1). De manera global, para el análisis de las muestras de semen se realiza un examen macroscópico, en el que se analizan parámetros como el volumen y la licuefacción, y un examen microscópico. Este último puede llevarse a cabo con un analizador automático, en el que se estudian características como la movilidad y la concentración (2-4).

La criopreservación seminal es la técnica que nos permite conservar espermatozoides a bajas temperaturas y mantenerlos durante largos periodos de tiempo sin que pierdan su capacidad fecundante; manteniendo así su viabilidad y funcionalidad y frenando los procesos de envejecimiento y degeneración celular. Esta técnica está especialmente indicada en varones que van a someterse a vasectomía, tratamientos con quimioterapia o radioterapia, así como en aquellos que por diversas razones presenten dificultades para obtener una eyaculación normal o con muy mala calidad espermática. Existen otras situaciones en las que también es recomendable la criopreservación espermática como es el caso de pacientes que se encuentren en el programa de donación de ovocitos y de profesionales que viajan frecuentemente. Se trata de una herramienta fundamental en reproducción asistida ya que permite optimizar los tratamientos y preservar la fertilidad en pacientes que, potencialmente, pueden perderla ( 5-7).

En general no existen criterios de selección de muestras para congelación, excepto en el caso de los donantes de semen que deben cumplir los criterios establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS); no hay parámetros espermáticos de análisis inicial que permitan una correlación positiva con la supervivencia espermática (4).

Las dificultades de la congelación derivan de los procesos de enfriamiento y calentamiento, y no de la permanencia a bajas temperaturas, puesto que a estas no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo reacciones químicas (4-5).

Para minimizar los efectos nocivos del enfriamiento es necesario utilizar medios de congelación; constituidos por componentes ácidos, básicos y nutrientes que aportan energía a las células espermáticas, debiendo ser, además, soluciones isosmóticas con el plasma seminal, de semejante fuerza iónica, capacidad tampón y un pH cercano a la neutralidad. Las células poseen una velocidad de enfriamiento óptima donde los daños producidos son mínimos. Además, al utilizar soluciones de congelación, la existencia de solutos en el agua disminuye el punto de congelación produciéndose la cristalización del agua a temperaturas menores a la del punto de congelación del agua pura (0°C) (5-6).

Los crioprotectores (CPA) presentes en los medios de congelación son sustancias hidrosolubles de baja citotoxicidad que evitan o disminuyen la formación de cristales de hielo al bajar la temperatura mínima a la que una solución se encuentra en estado líquido (5-6).

Las muestras pueden sufrir alteraciones durante el periodo de almacenamiento, que se pueden traducir en una supervivencia nula después de la descongelación.

Dos de los medios más empleados son SpermCryo™All-round (Cryos International) y CryoSperm™ (Origio). El primero está compuesto por HEPES, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, hidrogenofosfato de sodio, carbonato sódico, lactato de calcio, sacarosa, glucosa, glicina, cloruro de sodio, glicerol y albúmina de suero humana (HSA); sus principales características es que no contiene albúmina de huevo ni antibióticos, como CPA penetrante tiene el glicerol y como no penetrantes sacarosa y glucosa. El segundo por HEPES, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, sulfato de gentamicina, glucosa, glutamina, cloruro de sodio, glicerol, glicina, agua Milli-RX, rafinosa, bicarbonato sódico, L-lactato de sodio, fosfato sódico, piruvato sódico y taurina; se caracteriza por no contener HSA y usar una mezcla de glicerol (CPA penetrante) y rafinosa (CPA no penetrante, al igual que la glucosa) como crioprotectores (8-10).

Durante la descongelación se producen cambios osmóticos inversos a los de la congelación que es necesario tener en cuenta para obtener muestras en las mejores condiciones (5).

En vista de la importancia de optimizar la técnica de criopreservación, en cuanto a viabilidad y supervivencia de los espermatozoides a este proceso, y con ello obtener espermatozoides en número y con movilidad suficiente para poder ser utilizados en reproducción asistida, se realizó este estudio con el objetivo de comprobar si existía un efecto del tiempo de espera para el procesado de la muestra sobre la movilidad de los espermatozoides; si existían diferencias en la movilidad tras un proceso de congelación-descongelación entre una misma muestra tratada con dos medios de criopreservación diferentes, SpermCryo™All-round (Cryos International) y CryoSperm™ (Origio); y por último, si existía una mayor movilidad post-descongelación en muestras sometidas a un baño de nitrógeno líquido previo a su almacenamiento en los tanques de nitrógeno líquido que en aquellas en las que no se realizaba dicho paso.

 

MATERIAL Y MÉTODOS                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           Se utilizaron un total de 13 muestras de semen de diferentes pacientes procedentes del laboratorio general del CHUAC. Dichos pacientes se encontraban en estudio por problemas de la fertilidad de la pareja (PFP), los cuales acudieron a la consulta del ginecólogo/urólogo debido a la incapacidad de concebir un hijo tras un período de un año.

Dichas muestras fueron recogidas por el laboratorio general dentro del tiempo recomendado (inferior a 1 hora entre el eyaculado y la recepción de la muestra) y se sometieron a un análisis en el Sperm Class Analyzer®, entre otras pruebas. Del total del volumen del eyaculado restante (tras las pruebas realizadas por el laboratorio general) se usó para llevar a cabo este estudio un volumen superior a 1 ml en todos los casos, Este SCA se referenció como 1er SCA.

El diseño experimental consistió en la congelación de cada una de estas muestras con dos medios de criopreservación, SpermCryo™All-round (Cryos International, Aarhus, Dinamarca) y CryoSperm™ (Origio, Malov, Dinamarca), y para cada solución de criopreservación la mitad de los criotubos se sometió a un baño en nitrógeno líquido (Figura 1). El total de los criotubos fue almacenado a bajas temperaturas en tanques de nitrógeno líquido, en la fase gas del nitrógeno (a unos -150°C), durante al menos 1 semana. Posteriormente se verificó la criosupervivencia mediante la valoración de la movilidad post-descongelación.

Proceso de criopreservación de las muestras                                                   

En primer lugar se llevó a cabo un análisis inicial mediante el analizador automático Sperm Class Analyzer® 5.2 (MICROPTIC S.L., Barcelona, España) (al que se hará referencia como SCA FIV).

Se midió el volumen de la muestra, a continuación se colocó 0.2μL de semen en un portaobjetos  (Leja®) y se valoró en el microscopio para su análisis; manteniendo la muestra en todo momento a una temperatura de 37°C. Para aquellas muestras con un recuento de espermatozoides móviles igual o superior al 50 %, o con un recuento de espermatozoides igual o superior a 3 millones, se procedió a la congelación directa del eyaculado de forma programada (congelación en rampa) y para aquellas con un recuento de espermatozoides móviles inferior al 50 %, o con un número de espermatozoides inferior a 3 millones, se capacitó la muestra mediante gradientes y la congelación de la suspensión de espermatozoides se realizó en perlas.

Capacitación mediante gradientes

En un tubo de ensayo con 0.5 mL de SpermGrad™ (Vitrolife, Barcelona, España) al 90 % y 0.5 mL al 45 % se añadió la muestra de semen y se sometió a una centrifugación durante 15 min a 1100 rpm, se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 mL de G-IVF™ PLUS (Vitrolife) y se realizó una segunda centrifugación a 1100 rpm durante 5 min. Tras esta última centrifugación se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 mL de Sequential Fert™ (Origio). Al finalizar la capacitación se realizó un segundo análisis con el SCA® (SCA post-gradientes).

Adición del medio de criopreservación

Se dividió el volumen final de la muestra de semen o de la suspensión de espermatozoides en dos tubos. En uno de ellos se añadió el medio de criopreservación SpermCryo™All-round, en una proporción 1:3, y en el otro CryoSperm™, en una proporción 1:1. Trascurridos 30 minutos se procedió a la congelación mediante una de las dos técnicas mencionadas (en rampa o en perlas).

Congelación en rampa

Se distribuyó el semen diluido con el crioprotector en criotubos (Thermo Fisher Scientific Inc.), con un volumen de 0.8 mL en cada uno de ellos y se procedió a la congelación de forma programada utilizando un congelador biológico (CM 2000). El programa de congelación se muestra en la Tabla 1. Al finalizar este proceso los criotubos fueron almacenados en tanques de nitrógeno, en la fase gas del nitrógeno líquido.

Congelación en perlas

Se realizaron perlas de 50 ó 100 μl de la suspensión de espermatozoides diluida con el medio crioprotector. Para ello, con la ayuda de una pipeta, se dejó caer una gota de la suspensión sobre un pequeño pocillo realizado sobre nieve carbónica. Después de unos minutos se colocaron entre 2 y 4 perlas por criotubo (previamente enfriado en la nieve carbónica) para su posterior almacenamiento.

Almacenamiento

Una parte de los criotubos (la mitad correspondiente a cada crioprotector) se sometió a un baño de nitrógeno líquido, a continuación se almacenaron en tanque de nitrógeno líquido, en fase gas y a una temperatura de unos -150ºC durante al menos 1 semana.

Proceso de descongelación de las muestras                                    

Para la verificación de la criosupervivencia mediante la valoración de la movilidad post-descongelación con el SCA® fue necesaria la descongelación de las muestras siguiendo el siguiente protocolo:

La muestra o alícuota se transfirió a un tubo de ensayo  y se dejó descongelar a temperatura ambiente durante 10 minutos; pasado este tiempo se añadió 1 ml de medio G-IVF™ PLUS gota a gota y se centrifugó durante 5 min a 1100 rpm; se retiró el sobrenadante y se añadió un volumen de Sequential Fert™ igual al volumen de la muestra congelada en el criotubo. Se dejó reposar un par de minutos y se realizó la valoración mediante un análisis en el SCA®.

Tratamiento estadístico

Se realizó un análisis descriptivo de todas las variables recogidas. Para analizar las variaciones en los parámetros estudiados en los diferentes pasos del proceso experimental se utilizó el test de los rangos con signo de Wilcoxon. Se analizó la asociación entre el tiempo transcurrido desde el SCA del laboratorio general (1er SCA) al SCA de FIV (SCA FIV) y las variaciones en la movilidad de los espermatozoides utilizando el coeficiente de correlación Rho de Spearman. Se analizó la diferencia en los parámetros estudiados según el medio de criopreservación y el uso o no de nitrógeno líquido mediante el test U de Mann-Whitney y el test de Kruskall-Wallis.

El nivel de significación aceptado fue p-valor < 0.05. Los datos fueron analizados con el programa estadístico IBM SPSS Statistic 19.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EEUU).

 

RESULTADOS

La edad de los pacientes osciló entre los 30 y los 49 años, con una media de 38,15± 4,77 años y una mediana de 37 años (Figura 1).

El tiempo transcurrido entre el eyaculado y la recepción de la muestra se encontró en todos los casos por debajo del tiempo máximo recomendado por la OMS (60 min), con una mediana de aproximadamente 30 min. Siendo el tiempo transcurrido desde el eyaculado hasta el SCA del laboratorio general de  unos 40 min (Tabla 2).

Los resultados del análisis de los datos del 1er SCA realizado por el laboratorio general (dentro del tiempo recomendado por la OMS) mostraron una media y una mediana en la concentración de espermatozoides (en millones/mL) superior al valor límite inferior de referencia de la OMS (14,9 millones/mL), con valores que iban desde los 0,5 hasta los 94 millones/mL. En cuanto a la concentración de espermatozoides en el total de la muestra los valores oscilaban entre los 2,5 hasta los 469 millones/muestra, con una media y una mediana, también para este parámetro, superior al valor de referencia de la OMS (39 millones/eyaculado). Es el caso también del porcentaje de espermatozoides móviles (tipo a, tipo b y tipo c) que oscilaba entre el 22 y el 84 % (siendo en la mayoría de los casos inferior al 50 %); pero la media de los valores, y su mediana, superaban el  40 % (valor de referencia de la OMS). El porcentaje de espermatozoides progresivos (resultado de la suma del porcentaje de espermatozoides tipo a y tipo b) oscilaba en torno al 30 %; para este parámetro los valores extremos fueron un mínimo del 6 % y un máximo del 84 %. Por último, los no progresivos (que se corresponden a los espermatozoides tipo c) tuvieron una mediana del 18 % (Tabla 3).

El tiempo mínimo transcurrido entre la recepción de la muestra por el laboratorio general y la realización del SCA de FIV fue de 83 min y el máximo de 188 min, con una media de 153,2±29,6 min y una mediana de 162 min, aproximándose por lo tanto a las 3 horas y excediendo considerablemente el tiempo recomendado por la OMS. El tiempo entre los dos SCA’s (laboratorio y FIV) fue de 10 minutos menos, con respecto a los valores anteriores (Tiempo desde la recepción hasta el SCA de FIV) (Tabla 4).

En la Tabla 5 se mostraron los resultados de los parámetros medidos en los SCA’s realizados en el laboratorio de FIV (SCA’s FIV). Como se comentó el volumen de muestra utilizado fue en todos los casos superior a 1 mL (mínimo de 1.1 mL). El volumen máximo utilizado fue de 2,9 mL; la media de 1,8±0,7 mL y la mediana de 1,4 mL.

Comparando algunos de los valores del SCA de FIV con los criterios de la OMS (Tabla 6) se observó que el requisito que no cumplían la mayoría de las muestras era presentar un porcentaje de espermatozoides móviles superior al 40 %. En nuestro estudio el valor establecido (para decidir el procesado) fue un recuento de espermatozoides móviles igual o superior al 50 %, o un recuento de espermatozoides igual o superior a 3 millones.

Se descartaron diferencias significativas en la concentración de espermatozoides entre el SCA del laboratorio general y el SCA de FIV (Tabla 7).

Se observaron cambios significativos en el porcentaje de espermatozoides móviles, no progresivos e inmóviles, pero no se observaron cambios significativos en el porcentaje de espermatozoides progresivos, aunque era inferior en el SCA de FIV (Tabla 8). Era un 27 % inferior la cantidad de espermatozoides móviles en el SCA de FIV con respecto al SCA inicial, los cuales se acumulaban en los no progresivos, y los no progresivos en los inmóviles, es por esto que el porcentaje de espermatozoides inmóviles aumentó en cerca de un 20 %.

A mayor tiempo transcurrido entre el SCA inicial, del laboratorio general, y el SCA de FIV se observaron variaciones en el porcentaje de espermatozoides móviles, no progresivos (que presenta la asociación más alta ρ=0,539) e inmóviles; aunque ninguna de estas asociaciones era significativa (Tabla 9).

Del total de las muestras, dos de ellas (15,4 %) se congelaron empleando la congelación programada (congelación en rampa) y las once restantes (84,6 %) en perlas. En los resultados de frecuencias del SCA de FIV para estos dos grupos (Tabla 10) se observó que las muestras que fueron procesadas por perlas eran peores, como cabía esperar; la concentración de espermatozoides (en millones/mL) fue mucho menor, al igual que el porcentaje de espermatozoides móviles (32,2 % respecto al 66,4 %) y progresivos. Las medianas no diferían tanto en cuanto al porcentaje de espermatozoides no progresivos, pero sí lo hacían en el porcentaje de espermatozoides inmóviles, ya que para las muestras que se procesaron por perlas fue aproximadamente del 70 % y para las de rampa cerca de la mitad.

El SCA post-gradientes realizado a las 11 muestras que se capacitaron, destinadas a la congelación en perlas, mostró las mejoras esperadas tras la aplicación de dicha técnica con respecto al SCA de FIV (Tabla 11). Las diferencias fueron significativas para la concentración de espermatozoides (medida en millones/mL), que mostró un descenso de un 90 %; para el porcentaje de espermatozoides móviles, cuya cantidad aumentó en un 70 %; para la cantidad de espermatozoides progresivos que se duplicó; y para el porcentaje de inmóviles que descendió en un 40 % con respecto al SCA anterior.

El uso de un medio crioprotector u otro no mostró diferencias significativas en los resultados de movilidad post-descongelación (Tabla 12). Aunque las diferencias entre ambos no fueron significativas, el porcentaje de espermatozoides móviles y progresivos fue mayor en las muestras en las que se utilizó CryoSperm™.

Tampoco se encontraron diferencias significativas entre la aplicación de un baño de nitrógeno o no a los criotubos antes de su almacenamiento (Tabla 13).

Analizando los 4 grupos de forma independiente (Tabla 14) se confirmaron los resultados observados en las tablas anteriores. Independientemente del medio de criopreservación no había diferencias significativas entre aplicar el baño de nitrógeno o no. Por otro lado, se observó como con CryoSperm™ había cierta tendencia a tener mayor cantidad de espermatozoides móviles y progresivos, y menor cantidad de inmóviles, que con SpermCryo™ All-round.

Valorando los mismos parámetros que en la tabla anterior pero de manera independiente las muestras congeladas en rampa (Tabla 15) de las congeladas en perlas (Tabla 16), se observó para el caso de las congeladas en perlas la misma tendencia que en la tabla anterior (Tabla 14), en donde las muestras congeladas empleando CryoSperm™ mostraron mejores resultados de motilidad post-descongelación. En cuanto a las de rampa no se pudo concluir nada porque solo se procesaron por esta técnica dos muestras, pero parecía que se venían mejores resultados con SpermCryo™ All-Round.

En todos los test post-descongelación se vieron espermatozoides móviles.

DISCUSIÓN

Según los estudios epidemiológicos más amplios, la esterilidad afecta al 15 % de la población en edad reproductiva de los países occidentales y experimenta una evolución creciente (11). La criopreservación de esperma es un componente importante de la gestión de la fertilidad y gran parte de su aplicación exitosa parece afectar al resultado de las TRA (7). Es por esto que optimizar las técnicas de criopreservación, y con ello obtener espermatozoides en número y con movilidad suficiente para poder ser utilizados en reproducción asistida, es de gran importancia.

Nuestros resultados muestran que existe un efecto del transcurso del tiempo sobre la movilidad. Hubo cambios en los parámetros de movilidad entre el primer SCA realizado por el laboratorio general y el SCA de FIV realizado sobre 152 min después. Se observaron variaciones significativas en el porcentaje de espermatozoides móviles y no progresivos, que disminuyeron, y en el de inmóviles, que aumentaron; aunque la correlación entre el tiempo y las variaciones no fue significativa. Así, un estudio anterior (12) vio que la motilidad del esperma disminuye cuando el tiempo entre la eyaculación y el análisis aumenta, y que disminuyó de manera significativa a los 60 min después de la eyaculación, aproximadamente en un 20 %. Dicha disminución de la motilidad debe ser debida al efecto de las especies reactivas de oxígeno (ROS), y secundariamente a un sobrecrecimiento bacteriano o al agotamiento de nutrientes por la actividad metabólica de los espermatozoides.

Al comparar los resultados del SCA de FIV con algunos de los criterios de la OMS lo lógico sería que las muestras no cumpliesen dichos criterios, pues las muestras proceden de pacientes en estudio por PFP. Nuestros resultados mostraron que un bajo porcentaje de muestras cumplía el requisito de un porcentaje de espermatozoides móviles superior al 40 %, lo que indicaba astenozoospermia. Además en muchas de ellas se observaban aglutinaciones de espermatozoides y un gran número de células redondas. Las anomalías en cuanto a movilidad pueden variar en cuanto a su gravedad, y frecuentemente se presentan asociadas con los otros dos parámetros  fundamentales, cantidad o concentración de espermatozoides en el eyaculado y su morfología. El grado de las alteraciones se relaciona con la probabilidad de lograr una gestación espontánea, aunque no todas las alteraciones tienen el mismo significado pronóstico (11).  

La criopreservación espermática es una técnica que ha permitido la conservación, durante un tiempo “indefinido”, de células hasta el momento en que van a ser utilizadas en los procedimientos de reproducción asistida. A pesar de que este procedimiento amplió las alternativas de tratamiento de la infertilidad, aún hay una pérdida importante debida al daño celular que ocasiona la congelación (13). La recuperación de un número óptimo, de espermatozoides funcionalmente intactos de muestras descongeladas, siempre ha sido el objetivo principal de la criopreservación del semen (14). En este estudio, a pesar de los daños ocasionados por el paso del tiempo entre eyaculado y procesamiento y la congelación, hay que destacar que los test post-descongelación mostraron que había espermatozoides en número suficiente para realizar TRA; con los avances producidos en las técnicas de reproducción asistida, la presencia de un único espermatozoide en la muestra criopreservada es suficiente para realizar una ICSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides).

A pesar de que los espermatozoides, en comparación con otros tipos celulares, parecen ser menos sensibles a la criopreservación esta puede conducir a cambios perjudiciales en la estructura y función de los espermatozoides (7). La disminución de la motilidad de los espermatozoides se ha atribuido al daño en la membrana mitocondrial (un deterioro de la actividad mitocondrial puede explicar la reducción de la motilidad, pues el ATP generado por la fosforilación oxidativa en la membrana mitocondrial interna se transfiere a los microtúbulos, para llevar a cabo el movimiento). Aunque la motilidad no está directamente relacionada con la capacidad de fecundación, es uno de los factores más importantes que afectan a la calidad del esperma (7, 14).

Nuestro estudio mostró una tendencia a obtener mejores resultados y una mayor movilidad post-descongelación en las muestras con medio de criopreservación CryoSperm™ que con SpermCryo™All-round, pero la diferencia no fue significativa. Un uso apropiado de los medios de criopreservación es uno de los factores de mayor impacto en la prevención de la fragmentación del ADN, mejorando así las tasas de supervivencia espermática (7). Las diferencias encontradas pueden ser debidas a que SpermCryo™All-round es un medio más denso que en pequeños volúmenes (muestras destinadas a congelación en perlas) puede tener menor éxito de penetración en las células, mientras que los medios que se añaden en una proporción 1:1, siendo actualmente los más utilizados, como CryoSperm™, tienen más probabilidades de conseguir penetrar en una mayor cantidad de células y, por tanto mostrar unos mejores resultados de movilidad post-descongelación (8,13,15). Aun así SpermCryo™ All-round puede tener un mejor funcionamiento en muestras congeladas en rampa, donde se criopreserva una mayor cantidad de volumen y, proporcionalmente, se añade un mayor volumen de medio de criopreservación.

En nuestro estudio se observó que no existían diferencias significativas para ninguno de los parámetros estudiados entre las muestras sometidas a un baño de nitrógeno líquido previo a su almacenamiento en los tanques de nitrógeno líquido comparado con aquellas en las que no se realiza dicho paso. Hoy en día sólo existe la tendencia a almacenar en nitrógeno líquido embriones vitrificados (16) todos los otros tejidos o células normalmente se almacenan en fase gas debido al riesgo de contaminación cruzada durante el almacenamiento en fase líquida y a que no se han visto diferencias en viabilidad entre una forma de almacenamiento u otra (17).

Por último hay que añadir que existe una gran variación entre individuos en la susceptibilidad de los espermatozoides a la criopreservación; como ya se comentó no hay parámetros espermáticos de análisis inicial que permitan una correlación positiva con la supervivencia espermática (a mayor cantidad de espermatozoides móviles por dosis no se obtienen mejores resultados tras la descongelación) (4,14).

En conclusión, este trabajo refleja que los pacientes en estudio por PFP presentan, en algunos de los parámetros estudiados, valores por debajo de los recomendados por la OMS, lo que podría explicar los problemas de fertilidad que presentan; la importancia del tiempo en la disminución de la calidad espermática; pero sobretodo la necesidad de ajustar el protocolo de congelación a las características de la muestra para así mejorar los resultados post-descongelación. Aunque en el proceso de congelación-descongelación se vea disminuida la viabilidad de los espermatozoides, la criopreservación es una valiosa herramienta de ayuda clínica en la gestión de la infertilidad.

 

AGRADECIMIENTOS

Al personal del Laboratorio de área por la cesión de las muestras de semen para el estudio y al personal de la Unidad de Fecundación in vitro del Hospital Modelo por la cesión del medio crioprotector.